牦牛乳制品中馬尿酸和苯甲酸含量快速檢測方法

劉怡雯，唐善虎，*，李思寧，宋凱紅

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041；2.四川新華西乳業有限公司，四川成都611732）

馬尿酸和苯甲酸普遍存在牛乳制品中，據報道馬尿酸含量為 30 mg/L～60 mg/L、苯甲酸為 0～22.7 mg/L[1]。有研究表明，牛乳在發酵形成酸奶過程中，乳酸菌能夠將馬尿酸轉化為苯甲酸，但此反應不能逆向進行[2]，從而導致酸奶中苯甲酸的含量高于普通乳制品。

目前苯甲酸及其鈉鹽是我國最常用的食品添加劑之一，GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》給出了苯甲酸及其鈉鹽的安全使用范圍，但同時也規定了酸奶中不允許添加苯甲酸及其鈉鹽，并有研究表明，長期攝入過量苯甲酸會導致神經興奮、腹瀉甚至可能會引發癌癥[3-4]。

牦牛是高海拔牧區的特色畜禽資源，其所產的牦牛奶富含豐富的氨基酸、鈣、鐵、鋅、維生素等營養物質，相比普通牛奶，牦牛乳含有更高的功能性脂肪酸和蛋白質，越來越受到人們的喜愛[5]。但由于高原牧區經濟落后，牦牛乳長期以來主要以自給自足的方式進行生產，在生產過程中由于手工采集、器皿清潔的不達標、較差的衛生環境、質量的不穩定等因素導致其苯甲酸含量過高，限制了牦牛乳市場發展，導致其無法登上中國乳制品的主流銷售渠道[6]。為了保障牦牛酸乳品質質量和特性，打造地方特色產品品牌，更好地促進地區經濟發展和農牧民增收致富，我們迫切地需要建立牦牛乳中馬尿酸轉化為苯甲酸動態檢測的方法、制定牦牛酸奶中馬尿酸、苯甲酸的最高限量，從而保證人們的食品安全、提高牧區百姓的收入。

國外目前主要利用毛細管電泳[7]、氣相色譜[8]和液相色譜[9-14]等方法來檢測乳制品中馬尿酸、苯甲酸含量，但大部分方法主要集中于分開檢測兩種物質，同時檢測兩種物質的方法報道尚少。與此同時，國內有關同時檢測馬尿酸和苯甲酸的食品安全國家標準尚屬空白，相關研究也相對較少。高效液相色譜法是檢測馬尿酸和苯甲酸最為常用的方法之一，具有設備普及率高、操作簡單、檢測成本低等特點[15-16]。鑒于以上研究，本文參考章唯[17]、趙貞等[18]學者在高效液相色譜對馬尿酸、苯甲酸同時檢測方法的基礎上，通過討論比較不同比例的流動相、流速、沉淀劑等因素對檢測結果的影響情況，從而對其進行優化選擇，建立一種更加快捷、靈敏度高、重現性好的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters2695高效液相色譜儀、TB-215D分析天平：北京賽多斯儀器系統公司；KQ5200DB超聲清洗器：中國曙峰企業；甲醇（色譜純）、乙酸（色譜純）、乙酸銨（色譜純）、草酸鉀（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、乙酸鉛（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、正己烷（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；馬尿酸標準品（純度98%）、苯甲酸標準品（純度98%）：上海源葉生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液的制備

草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液：稱取草酸鉀15 g、磷酸氫二鈉35g，加少量水，充分攪拌溶解，定容至500 mL。

乙酸鉛溶液：稱取100 g乙酸鉛，加少量水，充分攪拌溶解，定容至500 mL，配制成質量濃度為200 g/L的溶液。

亞鐵氰化鉀溶液：稱取53 g亞鐵氰化鉀，加少量水，充分攪拌溶解，定容至500 mL。

乙酸鋅溶液：稱取109.5 g二合水醋酸鋅，加水溶解后，再加入16 mL冰乙酸，加少量水，充分攪拌溶解，定容至500 mL。

乙酸銨溶液：稱取0.77 g乙酸銨，加水溶解，充分攪拌溶解，定容至500 mL，配制成濃度為0.02 mol/L的溶液。

馬尿酸儲備液：準確稱取0.0500g馬尿酸，用10mL甲醇溶解，加少量水，超聲充分溶解，定容至50 mL，配制成質量濃度為1 mg/mL的馬尿酸溶液。

苯甲酸儲備液：準確稱取0.0500g苯甲酸，用10mL甲醇溶解，加少量水，超聲充分溶解，定容至50 mL，配制成質量濃度為1 mg/mL的苯甲酸溶液。

1.2.2 樣品處理

液固態樣品：準確稱取樣品（5.00±0.05）g于試管中，待測。

乳粉樣品：準確稱取樣品（3.00±0.05）g于試管中，加入10 mL 40℃左右溫水溶解，待測。

在上述準備好的樣品中加入乙酸鉛溶液和草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液各4 mL，渦旋1min，50℃超聲20 min，8 000 r/min離心10 min，取其上清液，加5 mL正己烷，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，取其下清液轉入50 mL定容瓶中，加水定容，搖勻，上述溶液再經0.45 μm濾膜過濾，待液相色譜分析測定。

1.2.3 樣品沉淀劑的選擇

蛋白質沉淀常用的方法有酸堿沉淀法、無機重金屬沉淀法和有機沉淀法[19]等。本試驗選擇重金屬沉淀法來除去牦牛酸奶的蛋白質。通過查閱相關文獻，本試驗選擇亞鐵氰化鉀-乙酸鋅和乙酸鉛2種沉淀劑，通過比較其濾液澄清度、樣品回收率確定出最佳沉淀劑。

1.2.4 檢測波長的選擇

通過waters儀器二級管陣列檢測器對馬尿酸、苯甲酸在190 nm～400 nm范圍內進行全波段掃描，確定出最佳檢測波長。

1.2.5 流動相的選擇

通過查閱文獻可知，在馬尿酸和苯甲酸高效液相色譜法中有機相通常是甲醇，水相是乙酸和乙酸銨兩種物質[19-20]。本試驗將甲醇作為有機相，比較乙酸和乙酸銨兩種水溶液；通過分析討論馬尿酸、苯甲酸的檢測時間、分離效果、峰面積等因素比較乙酸和乙酸銨兩種水溶液，從而選擇出更適宜的水相。

1.2.6 流動相的最佳比例

根據上述試驗的結果，在流速1 mL/min、進液量20 μL、馬尿酸和苯甲酸混合標準液濃度為1 μg/mL的條件下，探究流動相的比例，確定流動相的最佳比例，具體比例設定見表1。

表1 流動相比例的設定Table 1 Setting of mobile phase ratio

1.2.7 流速的選擇

根據上述試驗，在最佳流動相比例的條件下，比較不同流速對馬尿酸、苯甲酸分離情況，選出最適宜的流速。具體設定見表2。

表2 流速的設定Table 2 Flow rate setting

2 結果與分析

2.1 樣品沉淀劑的確定

本試驗分析討論了樣品加標后分別采用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅和乙酸鉛—草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液2種沉淀劑處理，其馬尿酸、苯甲酸的回收率及樣品過濾后澄清度情況，從而確定出最適宜的沉淀劑。具體數據見表3。

表3 不同沉淀劑處理樣品后馬尿酸、苯甲酸的回收率及相對標準偏差結果Table 3 Result of rate of recovery and relative standard deviation（RSD）of hippuric acid and benzoic acid after treatment with different precipitators

由表3可知，加標樣品選用乙酸鉛—草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液處理后，其澄清度和回收率、精確度都普遍優于用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅溶液處理的樣品。（趙貞等[18]在利用高效液相色譜法檢測乳品中的馬尿酸和苯甲酸研究中，通過比較不同沉淀劑對樣品沉淀的效果也認為乙酸鉛—草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液的沉淀蛋白效果最佳。）祝偉霞等[20]在探討測定乳制品中苯甲酸和山梨酸含量的方法中選用乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液作為沉淀劑，樣品加標回收率為87.4%～110.0%。王淼等[21]建立的高效液相色譜法同時測定乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜和糖精鈉的方法中利用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅溶液作為沉淀劑，方法回收率在95.0%～103.0%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.70%～2.03%。祝偉霞和王淼等[20-21]得出的乙酸鋅-亞鐵氰化鉀處理后樣品加標回收率普遍高于本試驗苯甲酸的加標回收率，這可能是由于牦牛酸乳的pH值跟普通牛乳存在差異所導致，考慮到亞鐵氰化鉀對眼睛、呼吸系統及皮膚有一定的刺激性并受熱分解，對檢測人員身體存在安全隱患，綜上所述，選擇乙酸鉛—草酸鉀-磷酸氫二鈉溶液作為樣品沉淀劑。

2.2 檢測波長的確定

經waters儀器二級管陣列檢測器對馬尿酸、苯甲酸在190 nm～400 nm范圍內進行全波段掃描，為避免低波長雜質的干擾，本試驗綜合考慮，選擇230 nm作為檢測波長。而章唯[17]在紅原牦牛乳制品中苯甲酸溯源分析研究中選擇的最佳檢測波長為235 nm，這可能是由于不同的儀器和流動相導致在不同波長下馬尿酸和苯甲酸的響應值略有不同。

2.3 流動相的確定

本試驗在有機相為甲醇，有機相與水相比例為50∶50（體積比）的條件下，0.4%乙酸溶液和 0.1 mol/L乙酸銨溶液分別為水相時，比較檢測物質的檢測時間、檢測時間及峰面積，確定出最佳流動相。具體數據見表4。

表4 不同流動相的檢測結果Table 4 Detection results of different mobile phases

由表4可知選擇乙酸銨鹽類作為流動相時，馬尿酸和苯甲酸的檢測時間為20 min，此外，每次上機前需要用高水相（10%甲醇）過濾沖洗，以避免造成堵塞，檢測周期準備時間長，不利于馬尿酸、苯甲酸的快速檢測；而選擇0.4%乙酸水溶液無需使用高水相進行過濾沖洗，馬尿酸和苯甲酸檢測時間僅為15 min，且馬尿酸、苯甲酸的峰面積大小在不同流動相下差異不明顯，且操作更加簡單、檢測周期短。綜上所述，本試驗確定將0.4%乙酸水溶液和甲醇作為流動相。

2.4 流動相的最佳比例

本試驗在甲醇-0.4%乙酸水溶液作為流動相，檢測波長230 nm，進液量20 μL，馬尿酸、苯甲酸混合標準液濃度為1 μg/mL的條件下，通過單標、混標和空白對照的方式確定樣品中馬尿酸、苯甲酸的定性位置，采用單因素試驗設計方法，流速為1.0 mL/min，甲醇與0.4%乙酸水溶液的體積比從60∶40調整到40∶60，得到的結果見圖1。

由圖1A可知，當流速為1.0 mL/min，甲醇∶0.4%乙酸水溶液=60∶40（體積比）時，馬尿酸出峰時間為3.26 min，苯甲酸出峰時間為5.49 min。該條件下馬尿酸出峰時間太早，與雜質峰出峰時間接近，樣品峰將出現嚴重重疊，不適宜作為樣品的分析條件。

由圖1B可知，當流速為1.0 mL/min，甲醇 0.4%乙酸水溶液=50∶50（體積比）時，馬尿酸出峰時間為3.89 min，苯甲酸出峰時間為8.57 min。該條件下馬尿酸出峰時間與雜質峰基本分離，兩樣品峰完全分離，適宜作為樣品的分析條件。

圖1 流動相的比例選擇Fig.1 Selection of the proportion of mobile phase

由圖1C可知，當流速為1.0 mL/min，甲醇∶0.4%乙酸水溶液=40∶60（體積比）時，馬尿酸出峰時間為5.13 min，苯甲酸出峰時間為15.29 min。該條件下馬尿酸出峰時間與雜質峰基本分離，兩樣品峰完全分離，但流動相若水相比例較大的話，在大批量樣品處理過程中，對柱子的損傷較大，且隨著水相的增加，檢測時間有15 min增加到25 min，檢測周期加長，故不適宜作為本試驗樣品的分析條件。

綜上所述，本試驗的流動相最佳比例確定為甲醇∶0.4%乙酸水溶液=50∶50（體積比）。

2.5 流速的確定

本試驗采用單因素試驗設計方法，流動相為甲醇∶0.4%乙酸水溶液=50∶50（體積比），流速從1.0 mL/min調整到0.8 mL/min，得到的結果見圖2。不同流速下，馬尿酸和苯甲酸的平均峰面積值見表5。

圖2 不同流速下的峰面積Fig.2 Peak area at different velocities

表5 馬尿酸、苯甲酸的平均峰面積（±s）Table 5 Average peak area of hippuric acid and benzoic acid（±s）

表5 馬尿酸、苯甲酸的平均峰面積（±s）Table 5 Average peak area of hippuric acid and benzoic acid（±s）

流速/（mL/min）標準品（1 μg/mL）馬尿酸 苯甲酸1.0 72 619±106 114 196±118 0.9 77 278±68 120 424±89 0.8 90 399±97 142 381±103

通過比較馬尿酸、苯甲酸在不同流速下的平均峰面積可知，隨著流速降低，馬尿酸、苯甲酸的平均峰面積逐漸增大，峰寬增大。考慮到峰型和試樣樣品成分復雜，為避免流速過低，雜質可能無法不能完全沖出色譜柱從而導致色譜柱堵塞等因素，將本試驗的流速確定為0.9 mL/min。

2.6 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析

通過試驗數據最終確定HPLC色譜條件為：測定波長：230 nm；色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 ∶0.4%乙酸水溶液=50 ∶50；流速：0.90 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；進樣時間15 min。以此條件得到標準品和耗牛酸奶的HPLC圖見圖3和圖4。

由圖4可知，馬尿酸于4.33 min出峰，苯甲酸于9.52 min出峰。兩者出峰時間不同，馬尿酸、苯甲酸得到了很好的分離。

圖3 標準品的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of standard products

2.7 標準曲線建立、線性范圍、檢出限

圖4 牦牛酸奶的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of yak yoghurt

配制濃度為 0、2.5、5.0、10、25、50、100 μg/mL 的馬尿酸苯甲酸混合標準溶液，測定峰面積，以峰面積對濃度制作標準曲線，建立線性方程：馬尿酸：y=10-5x+0.106 9；R2=0.999 9；苯甲酸：y=8-6x+0.256 8；R2=0.999 5。由此可知2種物質的線性關系良好，R2均大于0.999。最低檢測濃度按3倍信噪比，進樣20 μL計算，最低檢測限為 0.038 μg/mL，線性范圍 1 μg/mL ～100 μg/mL。謝國祥等[22]在乳制品中馬尿酸的檢測及其在發酵過程中的動態變化研究表明在以C18為固定相，甲醇-水-醋酸體系為流動相，最低檢出量為1.8 ng，最低檢出濃度為0.09 mg/kg。趙貞等[18]在高效液相色譜法同時檢測乳品中的馬尿酸和苯甲酸研究中，在C18反相色譜柱分離，以乙酸銨-甲醇溶液為流動相條件下，按照信噪比RS/N=10計算得出，馬尿酸和苯甲酸的定量檢出限為1 mg/kg。屈莉等[15]在高效液相色譜法直接測定尿中馬尿酸的研究中，采用甲醇：磷酸鹽緩沖液（20∶80，體積比）為流動相，流速0.8mL/min，PE4.6×150mm C18/5 μm柱分離，二極管陣列檢測器檢測波長220 nm，方法檢出限為1.2 mg/L。由此可知，本試驗建立的高效液相色譜法同時測定牦牛酸乳中馬尿酸、苯甲酸的檢出限比之前相關學者建立的方法得出檢測限更低，對馬尿酸、苯甲酸在發酵過程中的動態檢測將更加精準。

2.8 回收率和精密度

發酵乳樣品中加入不同濃度的馬尿酸和苯甲酸，平行測定5次，每個樣品添加標準品后，渦旋10 s，放置10 min，再按提取凈化與測定的步驟進行含量的測定，得出平均回收率和相對標準偏差。具體結果見表6、表 7。

表6 發酵乳樣品的添加回收率結果Table 6 Results of added recovery of fermentation milk samples

由表6、表7可知，本方法測定馬尿酸平均回收率為96.79%～98.10%，RSD為0.58%～1.07%，苯甲酸平均回收率為93.54%～98.99%，RSD為0.71%～1.19%；對加標的牛乳和發酵乳樣品平行測定5次，RSD值分別為0.58%和1.07%。章唯[17]在紅原牦牛乳制品中苯甲酸溯源分析中建立了高效液相色譜法同時檢測牦牛奶粉中馬尿酸和苯甲酸的方法，馬尿酸、苯甲酸的平均回收率為88.6%和92.23%。趙貞等[18]建立了高效液相色譜法同時檢測乳品中的馬尿酸和苯甲酸方法，該方法馬尿酸平均回收率為95.3%～97.7%，相RSD為0.37%～1.52%，苯甲酸平均回收率為102.7%～103.6%，RSD為0.57%～1.33%。綜上所述，本試驗建立的方法在回收率、精確度和重現性上優于章唯[17]學者建立的高效液相方法，雖然苯甲酸的回收率不及趙貞等[18]檢測的方法，但是差異不大，重現性更好。

表7 方法精密度試驗結果Table 7 Precision experiment results of the method

3 結論

本研究建立優化了牦牛酸乳中馬尿酸和苯甲酸的 HPLC 檢測方法，在C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）為分離柱，檢測波長為230 nm，進液量為20 μL條件下，流動相為甲醇與0.4%乙酸水溶液，其體積比為50∶50，流速為0.9 mL/min時，最低檢測限為0.038 μg/mL，在線性范圍1 μg/mL～100 μg/mL內有良好的線性關系，R2＞0.999，尿酸平均回收率為96.79%～98.10%，RSD為0.58%～1.07%，苯甲酸平均回收率為93.54%～98.99%，RSD為0.71%～1.19%，馬尿酸和苯甲酸加標樣品5次平行測定的RSD值分別為0.58%和1.19%。該方法檢測時間短、回收率和精密度高、檢出限低，為監測牦牛乳制品中馬尿酸和苯甲酸的含量水平提供了一種可行的分析方法。