美拉德反應對南極磷蝦酶解液中非揮發性物質的影響

許丹，方益，何鵬飛，嚴忠雍，黃麗英，張小軍

（浙江省海洋水產研究所，農業部重點漁場漁業資源科學觀測實驗站，浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江舟山316021）

南極磷蝦（Euphausia superba）主要分布于南極洲水域，屬于高緯度低溫條件下生長的冷水蝦類，儲量巨大，全球資源的總量預估6.5億噸～10億噸，每年捕撈量達到4 500萬噸～1億噸，是全球重要的蛋白質資源之一[1-2]。南極磷蝦營養豐富，具有低脂肪、高蛋白的特點，蛋白含量可占全蝦鮮重的16.04%～17.81%，含有人體所需的全部氨基酸，8種必需氨基酸含量較高[3]，其中賴氨酸含量遠遠高于金槍魚、南美白對蝦和牛肉的含量[4]。此外，其富含多種不飽和脂肪酸，約占總脂類含量的49.1%～67.6%，其中DHA和EPA所占比例為89.2%和79.1%[5]；全蝦中鈣、鉀、鎂等多種礦物質元素含量為3.37%，磷蝦肌肉中含量為2.36%[3]，除上述營養物質外，南極磷蝦體內的類胡蘿卜素量較高，尤其是眼球部，約占總量的25%[6]。由于南極磷蝦所含營養價值較高，在加工上存在著巨大潛力，近年來受到越來越多研究人員的關注[3，7]。

對于食品而言，風味質量包括揮發性成分和非揮發性成分兩個方面。揮發性成分決定了食品的氣味特征，而非揮發性成分不僅影響食品的滋味，還是絕大多數揮發性成分的前體物質，對食品風味的產生有著十分重要的作用，主要包括含氮化合物（游離氨基酸、呈味核苷酸及其關聯化合物、甜菜堿、短肽）和不含氮化合物（有機酸、糖原、無機離子）等[8]。

目前南極磷蝦資源的研究多集中于酶解工藝、酶解液美拉德反應工藝及揮發性物質分析等方面，而南極磷蝦酶解液美拉德反應產物中非揮發性物質的相關研究很少。因此，本試驗以南極磷蝦酶解液為原料，與木糖進行美拉德反應，利用理化分析法對美拉德反應前后的呈味成分，包括含氮化合物和不含氮化合物進行分析，研究美拉德反應對南極磷蝦酶解液中非揮發性物質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦：由作業船在南極海域捕撈，捕撈后迅速保存在-30℃冰柜中，冷凍方式運到實驗室，貯藏于超低溫冰箱中備用。

動物蛋白水解酶（2×105U/g）、風味蛋白酶（1×105U/g）：食品級，諾維信（中國）生物技術有限公司；D-木糖：國藥集團化學試劑有限公司。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：邦西儀器科技（上海）有限公司；AL204電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；PT-10 pH計：美國Sartorious公司；LG10-2.4A高速離心機：北京醫用離心機廠；W205B電熱恒溫水浴鍋：上海申勝生物技術有限公司；UV-3100紫外-可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司；SYKAM S-433D全自動氨基酸分析儀：德國SYKAM公司；SC-80C全自動色差計：北京康光光學儀器有限公司；7900ICP-MS等離子體電感耦合質譜儀：美國安捷倫公司；ACQUITY UPLC I-Class-XEVOTQS超高效液相色譜-串聯質譜儀：美國waters公司；CP3380氣相色譜儀：美國瓦里安公司。

1.2 方法

1.2.1 南極磷蝦酶解液的制備

稱取一定量的南極磷蝦，加入1∶3（料液比，g/mL）水勻漿，于50℃和自然pH值下進行復合酶酶解，其中復合酶為動物蛋白水解酶和風味蛋白酶（1∶1，質量比），添加量為1 000 U/g，酶解3 h后于100℃下滅酶15 min，冷卻，離心去沉淀，乙酸鈣脫氟后即為南極磷蝦酶解液（Euphausia superba hydrolysate，EsH）。

1.2.2 南極磷蝦酶解液的美拉德反應

取EsH 60 mL，加入20 g/L木糖，于100℃反應60 min，即為南極磷蝦酶解液的美拉德反應產物（Euphausia superba hydrolysate-Maillard，EsH-M）。

1.2.3 褐變程度的測定

將EsH稀釋5倍，EsH-M稀釋20倍，于420 nm處測定吸光值。

1.2.4 色差的測定

用色差計分別測定EsH、EsH-M的L、a、b值。以EsH為對照，計算其色差ΔE，結果用平均值±標準偏差表示。

1.2.5 游離氨基酸的分析

各取5 mL EsH和EsH-M，分別加入等體積10%三氯乙酸，沉淀過濾，取濾液各稀釋20倍，采用SYKAM S-433D全自動氨基酸分析儀進行分析。

1.2.6 肽分子量分布的分析

將EsH、EsH-M各稀釋20倍后，0.22 μm濾膜過濾。采用超高效液相色譜儀測定。色譜柱：CSH C18 130A（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；柱溫：40℃；流動相 A為水，B 為乙腈；進樣體積 10 μL；檢測波長：214 nm。分子量校正曲線所用標準品為細胞色素C、抑酚酶、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸。

1.2.7 無機離子含量的測定

Na+和K+含量采用火焰原子吸收分光光度法（GB 5009.91-2017《食品安全國家標準食品中鉀、鈉的測定》）；Ca2+含量采用火焰原子吸收分光光度法（GB 5009.92-2016《食品安全國家標準食品中鈣的測定》）；Mg2+含量采用火焰原子吸收分光光度法（GB 5009.241-2017《食品安全國家標準食品中鎂的測定》）。

1.2.8 脂肪酸組成的測定

樣品前處理：采用酸水解-提取法，各取EsH、EsH-M 5 mL，加入焦性沒食子酸0.1 g，95%乙醇2 mL，蒸餾水4 mL，8.3 mol/L 鹽酸 10 mL，于 80℃水浴 40 min，水解完成后，取出冷卻至室溫。脂肪提取及之后步驟，參照GB 5009.168-2016《食品安全國家標準食品中脂肪酸的測定》操作。

色譜條件：DB-WAX 柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm）；檢測器溫度：240 ℃；進樣體積 1 μL；分流比 20 ∶1；流速1.5 mL/min；升溫程序：80℃保持3 min，然后以5℃/min的速度升至120℃，保持5min，接著以2℃/min的速度升至180℃，保持50 min，再以1℃/min的速度升至240℃，保持60 min。

1.2.9 數據分析

試驗數據采用SPSS18.0軟件中Duncan法進行各組之間的顯著性分析，采用Origin8.0對數據進行繪圖。樣品中脂肪酸、肽分子量結果分析采用峰面積歸一化法計算出各個脂肪酸的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 美拉德反應對酶解液褐變程度和色差的影響

褐變程度是檢測美拉德反應進程的一個重要指標，常用420 nm處的吸光值來表示，A420nm值增加表明美拉德反應最后階段類黑素的產生。

美拉德反應對酶解液褐變程度和色差的影響見表1。

表1 美拉德反應對酶解液褐變程度和色差的影響Table 1 Changes in browning and chromatic aberration before and after Maillard reaction

由表1可知，EsH-M中A420nm明顯大于EsH，增加了0.57倍。有研究表明[9]，美拉德反應高級階段，糖類物質裂解生成酮、醛類等無色小分子中間產物，該類產物自身或相互間會聚合生成類黑精等大分子褐色物質，使體系呈現出顯著的顏色特征。此外，顏色是美拉德反應一個非常重要而又直觀的反映指標，褐變反應開始為淺黃色，最終變為深褐色[10]，從表1中還可以看出，美拉德反應的發生，使L值下降，向黑度方向偏移；a值和b值都顯著性升高，a值向紅色方向偏移，b值向黃色方向偏移，尤其以b值變化最為明顯。這說明加熱使體系發生了美拉德反應并生成了有色物質，導致顏色加深，并且a值和b值偏移的方向符合美拉德反應產物的顏色，此結果與程恒等[11]的研究結果相一致。

2.2 美拉德反應對酶解液中氨基酸組成的影響

氨基酸（尤其是游離氨基酸）是美拉德反應的重要底物，美拉德反應前后酶解液中游離氨基酸含量如表2所示。

表2 美拉德反應對氨基酸組成的影響Table 2 Changes in free amino acid before and after Maillard reaction

續表2 美拉德反應對氨基酸組成的影響Continue table 2 Changes in free amino acid before and after Maillard reaction

由表2可知，EsH中共檢測出17種游離氨基酸，總量為3.18 g/100 g干物質，美拉德反應后，游離氨基酸總量損失8.49%。EsH游離氨基酸中含量較高的5種氨基酸為谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和精氨酸，其中谷氨酸的含量最為豐富，約占游離氨基酸總量的18.52%；呈鮮味氨基酸主要為天冬氨酸和谷氨酸，分別占游離氨基酸總量的11.73%和18.52%；組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸為苦味氨基酸，約占游離氨基酸總量的30.69%；精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸和脯氨酸既帶有苦味，又帶有甜味，約占游離氨基酸總量的22.07%。經美拉德反應后，EsH-M損失最多的6種氨基酸分別為亮氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸，損失率分別為34.18%、16.75%、16.67%、16.10%、12.37%，發現此5種氨基酸多為苦味氨基酸，表明美拉德反應能改良酶解液的苦味。此外，脯氨酸含量增加了25.00%，這可能是反應過程中，其他氨基酸經過轉化而來[12]。游離氨基酸不僅是食品中重要的營養物質，也是重要的滋味成分和氣味前體物質，同時還能與食品體系中的其他成分協同，影響其整體風味。美拉德反應后，氨基酸有所減少，是因為這部分氨基酸轉變為其他風味物質，成為重要的呈味物質[13-14]。

2.3 美拉德反應對酶解液肽分子量分布的影響

蛋白酶解液中存在著不同的分子量肽段，不僅發生熱降解產生美拉德反應的中間產物，而且直接參與美拉德反應[15]。美拉德反應對肽分子量分布的影響見表3。

表3 美拉德反應對肽分子量分布的影響Table 3 Changes in peptides before and after Maillard reaction mg/L

由表3可知，EsH-M中分子量大于189 Da的2個組分含量均發生顯著下降，同時伴隨著小于189 Da的組分含量明顯增加。據此推測，在此條件下南極磷蝦酶解液-木糖美拉德反應體系中肽段的熱降解作用遠大于交聯作用。鄭曉杰等[16]亦研究發現雞骨酶解液在弱酸條件下和木糖發生反應后，美拉德體系中分子量小于500 Da的組分含量顯著增加，大于500 Da的組分含量均發生顯著下降。趙謀明、劉平等[17-18]也報道了不同分子量肽段在美拉德反應過程中存在著熱降解情況。南極磷蝦酶解液各肽段與木糖發生美拉德反應的能力不同，其中451 Da～1 450 Da組分具有較高的美拉德反應活性，推測該肽段可能含有較高反應活性的末端氨基酸。

2.4 美拉德反應對酶解液中無機離子含量的影響

水產品中的咸味主要由Na+、K+、Mg2+等無機鹽產生，另外還包括氯化鈉、氯化鉀及鈉、鉀的磷酸鹽[19]。無機鹽的呈味作用不僅在于呈現出咸味，更重要的是某些離子成分會促進水產品中的有機成分的風味特性得以發揮[12]。據文獻報道[20]，Na+、K+是雪蟹、扇貝和短頸文蛤中共同的呈味活性物質。缺少Na+會使雪蟹、扇貝和短頸文蛤提取物中的甜味、咸味顯著下降；缺少K+會使雪蟹、扇貝和短頸文蛤提取物味道變淡，僅保留一點鮮味和特征風味。

美拉德反應對無機離子含量的影響見表4。

表4 美拉德反應對無機離子含量的影響Table 4 The content of inorganic ions in system before and after Maillard reaction mg/L

由表4可知，反應前后體系中的無機離子，均以Na+的含量為最高，對美拉德反應前后體系的呈味有極重要的貢獻。經過美拉德反應，Na+、K+、Mg2+含量分別增加了0.53%、4.21%、3.70%，但離子總含量無明顯變化。

2.5 美拉德反應對酶解液中脂肪酸組成的影響

美拉德反應對脂肪酸組成的影響見表5。

表5 美拉德反應對脂肪酸組成的影響Table 5 Fatty acid compositions of total lipids before and after Maillard reaction

由表5可知，采用氣相色譜-質譜法分別從EsH和EsH-M中鑒定出11種和4種脂肪酸。EsH脂肪酸總量為27.02 mg/100 g，其中含有飽和脂肪酸17.03 mg/100 g，且以 C16：0和 C10：0為主；還富含多不飽和脂肪酸C22：6n3和 C20：5n3共 5.67 mg/100 g，其中 C20：5n3含量較高。經過美拉德反應后，EsH-M中脂肪酸含量為2.20 mg/100 g，減少了91.86%的脂肪酸，減少組分以多不飽和脂肪酸為主，此外，還伴有飽和脂肪酸C13：0的增加。曹榮等[21]研究發現南極磷蝦中飽和脂肪酸含量占總量的32.31%，且以 C16：0和 C14：0為主，多不飽和脂肪酸占38.78%，以 C22：6n-3和 C20：5n-3為主，說明將南極磷蝦酶解并沒有破壞脂肪酸的組成。而美拉德反應由于酶解液在高溫下和木糖反應，導致不飽和脂肪酸呈現遞減趨勢，直至消失，此結果與肖作兵等[22]的研究結果一致，不飽和脂肪酸含量會隨著溫度的升高而呈現遞減趨勢，特別是多不飽和脂肪酸，含量隨溫度變化差異顯著。

3 結論

美拉德反應后，南極磷蝦中酶解液中多數游離氨基酸含量顯著降低，其中亮氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸損失率較大，說明這些氨基酸可能是參與美拉德反應以及對反應產物風味起主要作用的氨基酸；酶解液肽段中451 Da～1 450 Da組分具有較高的美拉德反應活性；無機離子含量以Na+含量最高；脂肪酸組成呈現減少趨勢，減少組分以多不飽和脂肪酸為主。