畢赤酵母對酸粥風味品質(zhì)形成的評價

折米娜，王玉榮，劉康玲，張振東，雙全，*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.湖北文理學院食品科學技術學院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽 441053）

酸粥是一種流行于陜北、晉北以及內(nèi)蒙古西部地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品[1]，其原料為糜米、大米、小米和糯米等，通過自然發(fā)酵而成[2]。由于其制作環(huán)境相對開放[3]，可能會由于環(huán)境中的氧氣、溫度和微生物等作用在發(fā)酵過程中發(fā)生水解或氧化反應，進一步分解為酯、醛和醇等化合物[4]，嚴重影響其風味品質(zhì)，從而導致酸粥產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)受到一定程度的限制。其中影響酸粥風味品質(zhì)的一個重要因素是微生物[5]。有研究發(fā)現(xiàn)在泡菜發(fā)酵的過程中，畢赤酵母屬酵母的大量繁殖會使其表面有白膜產(chǎn)生并帶有一定的惡臭味[6]，而李文亞[7]等在酸粥中也分離出畢赤酵母菌，并且證實其全程參與酸粥的發(fā)酵。然而關于畢赤酵母菌對酸粥風味品質(zhì)影響的研究還沒有文獻報道。

氣味是消費者對食品新鮮度及可接受度的重要感官指標之一[8]。目前食品中揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定主要通過電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography and mass spectrometry，GC-MS） 技術來實現(xiàn)。電子鼻又稱氣味掃描儀，是一種模擬動物嗅覺器官開發(fā)的高科技產(chǎn)品[9]。其利用氣體傳感器陣列的響應圖案來識別敏感氣味，能快速識別樣品中的揮發(fā)性成分，具有響應時間短、檢測速度快和誤差小等優(yōu)點[10]，在乳制品[11]、肉制品[12]、果蔬制品[13]和茶類[14]等方面有著廣泛的應用。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（GC-MS）是一種結(jié)合氣相色譜和質(zhì)譜的特性對食品中揮發(fā)性成分進行定量和定性檢測分析的方法[15]，在咖啡[16]、橄欖油[17]和紅酒[18]等方面都有研究報道。

本研究以分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市酸粥中的酵母菌與乳酸菌為試驗對象，通過單一菌株發(fā)酵和復配發(fā)酵相結(jié)合的手段進行酸粥樣品的制備。采用電子鼻結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對畢赤酵母發(fā)酵酸粥中揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類及含量進行分析，同時結(jié)合多元統(tǒng)計學方法探討畢赤酵母對發(fā)酵酸粥風味品質(zhì)的影響，以期為后續(xù)酸粥品質(zhì)改善和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糜米：市售；菌株：由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院民族特色食品研發(fā)團隊提供；葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、乙酸鈉、酵母粉、檸檬酸二銨、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、一水合硫酸錳和吐溫80均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

LXJIIB低速大容量多管離心機：上海安亭科學儀器廠；KH-100DY超聲波清洗機：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；PEN3電子鼻：德國Airsense公司；GCMSQP2020氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、SH-Rtx-Wax（30 m×2.25 mm×0.25 μm）色譜柱：島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酸粥的制作工藝

將糜米進行淘洗并瀝干，加入3倍體積的蒸餾水置于65℃水浴30 min。待溫度降至室溫（25℃～28℃）后接種微生物菌株進行酸粥的發(fā)酵。其中乳酸菌組與酵母菌組以接種量為5%（體積分數(shù)）分別接入乳酸菌和酵母菌，復配組分別接種2.5%（體積分數(shù)）乳酸菌與酵母菌。各組酸粥于30℃發(fā)酵30小時后煮沸，置于4℃?zhèn)溆谩＞晷畔⑷绫?所示。

表1 菌株信息Table 1 The information of strains

1.2.2 基于電子鼻技術對酸粥揮發(fā)性風味品質(zhì)評價

取酸粥樣品15 mL置于50 mL頂空瓶中，待樣品溫度為室溫后，進行電子鼻測定。測定條件：進樣時間為5 s，采樣時間為60 s，自動清洗時間為90 s，每個樣品測定3次，取平均值。電子鼻各傳感器信息如表2所示。

表2 電子鼻傳感器及對應敏感化學物質(zhì)Table 2 The electic nose sensors and their corresponding sensitive material types

1.2.3 基于GC-MS對酸粥揮發(fā)性風味物質(zhì)品質(zhì)評價

1.2.3.1 樣品前處理

取各酸粥樣品6 mL于20 mL頂空樣品瓶，立即用帶有聚四氯乙烯鋁帽夾緊封，備用。測試采用捕集肼模式，將樣品置于60℃，保溫30 min，進樣量為1 μL，進樣口解析5 min后，進入GC-MS分析。

1.2.3.2 GC條件

色譜柱：SH-Rtx-Wax-5ms（30 m×2.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：200 ℃；進樣方式：分流進樣；分流比：8∶1；載氣為高純氮氣；流速為1 mL/min；程序升溫：起始溫度40℃，保持3 min，以5℃/min升至50℃，保持10 min，繼續(xù)以6℃/min升至130℃，不保持，最后以10℃/min升至200℃，保持7 min。

1.2.3.3 MS條件

離子源溫度：250℃；接口溫度：280℃；離子化方式：EI；電子能量：70 eV；質(zhì)量掃描范圍：33～450（m/z）；采集方式：Q3 Scan。

1.2.3.4 定性分析

NIST14標準質(zhì)譜庫定性；保留指數(shù)定性。

1.2.3.5 定量分析

利用峰面積對樣品中主要組分進行相對含量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用主成分分析（principal component analysis，PCA）、典范對應分析（canonical correspondence analysis，CCA）、馬氏距離（mahalanobis distance）和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對酸粥揮發(fā)性風味物質(zhì)差異性進行分析；使用冗余分析（redundancy analysis，RDA）對與酸粥揮發(fā)性風味物質(zhì)整體結(jié)構(gòu)差異顯著相關的指標進行分析；使用配對t檢驗對酸粥主要揮發(fā)性風味物質(zhì)進行顯著性分析。除RDA采用Canoco4.5軟件外，其余分析均采用Matlab 2010b 軟件 （The Math Works，Natick，MA，USA）、Origin8.5軟件（OriginLab，MA，USA）作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于多元統(tǒng)計學方法的不同菌株發(fā)酵酸粥揮發(fā)性物質(zhì)的評價

研究首先采用電子鼻技術對各酸粥樣品的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析，利用主成分分析（PCA）對3組酸粥樣品間揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析。其PCA因子載荷圖如圖1所示。

由圖1可知，通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，3組發(fā)酵酸粥的揮發(fā)性風味物質(zhì)主要集中在前兩個主成分。其中第一主成分貢獻率為88.92%，包括W1C、W3C、W5C、W1S、W2S、W5S、W2W傳感器，通過表2可知主要包括芳香化合物、烷烴類、氮氧化合物和有機硫化物等化合物。第二主成分貢獻率為7.24%，其主要由是W6S和W3S傳感器組成，包括氫氣和甲烷。

本研究進一步使用典范對應分析（CCA）對3組發(fā)酵酸粥的風味品質(zhì)進行分析。基于CCA分析不同菌株發(fā)酵酸粥風味品質(zhì)評價如圖2所示。

由圖2可知，3組發(fā)酵酸粥在空間排布上呈現(xiàn)出連續(xù)性且存在明顯分離。其中乳酸菌組集中在左側(cè)，而其余兩組酸粥主要集中在右側(cè)。結(jié)合圖1因子載荷圖可以發(fā)現(xiàn)，導致乳酸菌組與其他兩組酸粥存在差異性的揮發(fā)性風味物質(zhì)可能是具有芳香的化合物。本研究進一步使用馬氏距離聚類方法對各組酸粥樣品的風味品質(zhì)進行差異性分析。基于馬氏距離不同菌株發(fā)酵酸粥風味品質(zhì)評價如圖3所示。

圖1 不同菌株發(fā)酵酸粥風味品質(zhì)PC1和PC2因子載荷圖Fig.1 Graphical representation of the principal component analysis of the flavor quality of different strain fermentated sour porridge

圖2 基于CCA不同菌株發(fā)酵酸粥風味品質(zhì)評價Fig.2 Canonical correspondence analysis of the flavor quality of different strain fermentated sour porridge

圖3 基于馬氏距離的不同菌株發(fā)酵酸粥風味品質(zhì)評價Fig.3 The cluster analysis of the flavor quality of different strain fermentation sour porridge based on Mahalanobis distance

由圖3可知，酵母菌組與復配組酸粥聚為一類，而乳酸菌組酸粥為一類，從而可知酵母菌組和復配組酸粥的風味品質(zhì)差異較小，而與乳酸菌組酸粥差異較大。進一步使用MANOVA多元統(tǒng)計分析方法對3組酸粥的整體揮發(fā)性物質(zhì)差異性分析發(fā)現(xiàn)，酵母菌組與復配組酸粥的氣味呈現(xiàn)出差異不顯著（P＞0.05），而與乳酸菌組酸粥呈現(xiàn)出差異極顯著（P＜0.001），由此認為不同菌株發(fā)酵酸粥樣品間的揮發(fā)性風味物質(zhì)存在一定的差異性。

2.2 基于冗余分析的不同菌株發(fā)酵酸粥揮發(fā)性物質(zhì)的評價

本研究進一步使用冗余分析（RDA）對3組發(fā)酵酸粥的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行評價，結(jié)果如圖4所示。

圖4 RDA雙序圖Fig.4 Biplot of the RDA

由圖4可知，傳感器W1C、W3C和W5C指標在RDA排序約束軸上呈現(xiàn)良好相關，則認為對上述傳感器所敏感的化學物質(zhì)代表了發(fā)酵酸粥整體風味差異顯著相關的主要揮發(fā)性風味物質(zhì)。由圖4亦可知，上述三類傳感器位于乳酸菌組一側(cè)，結(jié)合表2可知，W1C敏感的化學物質(zhì)為芳香化合物，W3C敏感的化學物質(zhì)為芳香化合物，W5C敏感的化學物質(zhì)為烷烴和芳香化合物。綜上所述，導致乳酸菌組與其他兩組酸粥揮發(fā)性風味物質(zhì)存在差異的主要風味物質(zhì)是具有芳香的化合物。

2.3 基于GC-MS技術對不同菌株發(fā)酵酸粥揮發(fā)性風味物質(zhì)的評價

本研究進一步使用GC-MS技術對各組酸粥樣品中揮發(fā)性風味物質(zhì)進行了定性和相對定量分析，其測得各組揮發(fā)性風味物質(zhì)平均相對含量結(jié)果如表3所示。

表3 酸粥樣品中揮發(fā)性組分及相對含量Table 3 The volatile components and relative content in sour porridge samples %

根據(jù)GC-MS數(shù)據(jù)顯示，30個發(fā)酵酸粥中共檢測到162種揮發(fā)性風味物質(zhì)。其中酯類化合物37種，烷烴類化合物53種，醇類化合物17種，醛類化合物18種，酮類化合物10種，酸類化合物10種，胺類化合物4種，其他類化合物12種。由表3可知，酯類和醇類化合物為酸粥樣品主要揮發(fā)性化合物，其平均相對含量均大于20%，而烷烴類化合物種類較多，但是各化合物平均相對含量較低。在眾多揮發(fā)性物質(zhì)中有5種化合物的平均相對含量大于5%，利用配對t檢驗方法對5種揮發(fā)性化合物進行差異性分析，如圖5所示。

圖5 揮發(fā)性化合物顯著性分析Fig.5 The analysis of the significance of volatile compounds

由圖5可知，5種揮發(fā)性風味物質(zhì)分別為乙酸乙酯、DL-丙氨酸乙酯、己醛、3-甲基-1-丁醇和乙醇。通過配對t檢驗發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯和乙醇在3組發(fā)酵酸粥中表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.01），己醛和3-甲基-1-丁醇表現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.001）。而DL-丙氨酸乙酯表現(xiàn)出無顯著性差異。由圖5亦可知，乳酸菌與酵母菌進行復配發(fā)酵后，乙酸乙酯、己醛和3-甲基-1-丁醇等化合物的含量上升。乙酸乙酯具有低毒性，含量低時有果香味，同時具有強烈的醚似的刺激性氣味[19]，乙醇具有特殊香味并伴有刺激的辛辣滋味。而己醛主要來自ω-6不飽和脂肪酸，具有清新的青草香，但是含量高時會有酸敗和令人作嘔的氣味[20-21]，3-甲基-1-丁醇有特殊不愉快氣味，同時還有辛辣而令人厭惡味。由此可知，乳酸菌單一發(fā)酵酸粥中乙酸乙酯、己醛和3-甲基-1-丁醇的平均相對含量較低，使酸粥的風味可以被大眾接受，而畢赤酵母單一發(fā)酵與復配發(fā)酵3種化合物的含量均會提升，都會嚴重影響到酸粥的品質(zhì)。據(jù)文獻報道，部分酵母菌可以在食物表面大量繁殖，并且產(chǎn)生肉眼可見的白色菌膜并引起食物發(fā)生變色或變質(zhì)現(xiàn)象[22]。目前在乳品[23]、肉品[24]以及果蔬[25]等中均發(fā)現(xiàn)畢赤酵母，而此類酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在一定程度上具有潛在致病性[26]。在酸粥發(fā)酵過程中，畢赤酵母菌發(fā)酵會有膜醭生成且伴有不愉快的氣味，由此看出添加畢赤酵母菌發(fā)酵后對酸粥的風味品質(zhì)影響較大。

該試驗進一步利用典范對應分析（CCA）對5種揮發(fā)性風味物質(zhì)進行有監(jiān)督空間排布，基于CCA分析不同菌株發(fā)酵酸粥代表性揮發(fā)性化合物品質(zhì)評價如圖6所示。

圖6 基于CCA不同菌株發(fā)酵酸粥代表性揮發(fā)性化合物品質(zhì)評價Fig.6 Canonical correspondence analysis of the representative volatile compounds quality evaluation of different strain fermentated sour porridge

由圖6可知，3組發(fā)酵酸粥在空間排布上呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢。其中乳酸菌組發(fā)酵酸粥集中在右側(cè)，而其余兩組酸粥集中在左側(cè)，這與試驗得出結(jié)論相符合。綜上所述，認為乳酸菌發(fā)酵酸粥揮發(fā)性風味物質(zhì)與酵母菌組和復配組發(fā)酵酸粥存在顯著差異，其造成差異的主要揮發(fā)性風味物質(zhì)為3-甲基-1-丁醇、己醛、乙酸乙酯和乙醇。

3 結(jié)論

本研究選用分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市酸粥中畢赤酵母和乳酸菌為研究對象，通過單一菌株發(fā)酵和復配發(fā)酵相結(jié)合的手段進行酸粥的制備，同時采用電子鼻結(jié)合GC-MS技術對酸粥中的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行評價。研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母單獨發(fā)酵及其與乳酸菌復配發(fā)酵制備的酸粥揮發(fā)性風味物質(zhì)無顯著差異，而與乳酸菌發(fā)酵酸粥有顯著差異，加之畢赤酵母在酸粥發(fā)酵過程中表面常形成白膜且具有一定的致病性，因而畢赤酵母對酸粥風味品質(zhì)形成無積極影響。通過本研究的實施對后續(xù)酸粥發(fā)酵劑的制備及酸粥的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了一定理論參考。