高糖環(huán)境下不同濃度黃芪注射液對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡及NF-κB表達(dá)的影響

梅莎莎，宋恩峰，項(xiàng) 瓊

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見并發(fā)癥，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，最終會(huì)發(fā)展為終末期腎衰竭[1-2]。腎小管上皮細(xì)胞的損傷在糖尿病腎病發(fā)病早期就已經(jīng)存在，可表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)和功能的損傷，如腎小管細(xì)胞各種炎癥反應(yīng)以及腎小管上皮細(xì)胞的凋亡[3]。腎小管上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡可導(dǎo)致腎小管損傷，加速腎功能衰竭。而高血糖作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，NF-κB作為炎癥介質(zhì)，可激活腎臟內(nèi)的一系列炎癥反應(yīng)，加重腎臟損害，加速糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[4-5]。中藥黃芪具有保護(hù)腎功能及降低血糖作用[6-7]，且筆者前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪注射液能夠抑制腎小管上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡及NF-κB的表達(dá)，對(duì)DN有保護(hù)作用[8-9]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討黃芪注射液濃度與細(xì)胞凋亡率、NF-κB蛋白表達(dá)間的關(guān)系，為臨床治療DN提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料 人近曲腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)，武漢大學(xué)人民醫(yī)院腎內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；黃芪注射液，哈爾濱圣泰制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z23020820；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM低糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶溶液、青-鏈霉素溶液、PBS，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；DMSO，sigma公司；Annexin V/PI凋亡試劑盒，Clontech 公司；流式細(xì)胞儀，Becton Dickinson 公司：PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天；PVDF膜，Millipore；GAPDH抗體，杭州賢至生物有限公司；NF-κBp65，Bioworlde；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，武漢博士德生物工程有限公司；ECL底物液，Thermo；顯影定影試劑盒，武漢巴菲爾生物。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人近曲腎小管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)于濃度為10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM低糖完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2～3 d可進(jìn)行傳代，傳代比例為1∶3，試驗(yàn)用第6代細(xì)胞。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組與處理 待細(xì)胞融合至80%，將培養(yǎng)基換成無(wú)血清DMEM低糖培養(yǎng)基同步化24 h后，棄去無(wú)血清培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為低糖組(低糖培養(yǎng)基含D-葡萄糖5.5 mmol/L)、高糖組(高糖培養(yǎng)基含D-葡萄糖25 mmol/L)、高糖+2 μg/mL黃芪注射液組(高糖培養(yǎng)基+2 μg/mL黃芪注射液)、高糖+20 μg/mL黃芪注射液組(高糖培養(yǎng)基+20 μg/mL黃芪注射液)、高糖+200 μg/mL黃芪注射液組(高糖培養(yǎng)基+200 μg/mL黃芪注射液)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h、72 h(前期試驗(yàn)[8]表明培養(yǎng)48 h、72 h能明顯降低凋亡率及NF-κB的表達(dá))，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h、72 h后胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞收集，用250 μL結(jié)合緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105mL-1，在重懸液中依次加入5 μL Annexin-Ⅴ-FITC和5 μL Propidium Iodide(PI)，混勻后避光在冰上孵育15 min。再加入400 μL 結(jié)合緩沖液后混勻，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析，每組測(cè)3次。

1.2.4NF-κB蛋白表達(dá)檢測(cè) 每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h、72 h后胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞收集。采用Western blot法測(cè)定。配制裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳。電泳結(jié)束后將凝膠移入轉(zhuǎn)膜緩沖液固定，轉(zhuǎn)膜完畢后將膜置人含5%(W/V) 脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)中，室溫下封閉1 h。加入一抗，搖床4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，用PBST洗滌3次后用封閉液稀釋熒光二抗，室溫下反應(yīng) 30 min，用PBST洗滌后加ECL底物液，孵育數(shù)分鐘。等熒光條帶顯示清楚后，將多余的底物液用濾紙吸出，待X膠片壓片好后進(jìn)行顯影和定影。

2 結(jié) 果

2.1各組培養(yǎng)不同時(shí)間腎小管上皮細(xì)胞凋亡率比較 培養(yǎng)48 h和72 h，高糖組細(xì)胞凋亡率均明顯高于低糖組(P均<0.05)；黃芪注射液各干預(yù)組細(xì)胞凋亡率均明顯低于高糖組(P均<0.05)，且高糖+200 μg/mL黃芪注射液組明顯低于高糖+2 μg/mL黃芪注射液組和高糖+20 μg/mL黃芪注射液組(P均<0.05)，高糖+20 μg/mL黃芪注射液組明顯低于高糖+2 μg/mL黃芪注射液組(P均<0.05)。見表1及圖1。

2.2各組培養(yǎng)不同時(shí)間NF-κB蛋白表達(dá)量比較培養(yǎng)48 h和72 h，高糖組NF-κB蛋白表達(dá)量均明顯高于低糖組(P均<0.05)；黃芪注射液各干預(yù)組NF-κB蛋白表達(dá)量均明顯低于高糖組(P均<0.05)，且高糖+200 μg/mL黃芪注射液組明顯低于高糖+2 μg/mL黃芪注射液組和高糖+20 μg/mL黃芪注射液組(P均<0.05)。見表2及圖2和圖3。

表1 各組培養(yǎng)不同時(shí)間腎小管上皮細(xì)胞凋亡率比較

注：①與高糖組比較，P<0.05；②與高糖+200 μg/mL黃芪注射液組 比較，P<0.05；③與高糖+20 μg/mL黃芪注射液組比較，P<0.05。

2.3高糖環(huán)境下黃芪注射液濃度、細(xì)胞凋亡率、NF-κB蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性 細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h，黃芪注射液濃度與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.856,-0.889,P均<0.05),與NF-κB蛋白表達(dá)量也呈負(fù)相關(guān)(r=-0.669,-0.704,P均<0.05)；NF-κB蛋白表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.828,0.765,P均<0.05)。

3 討 論

我國(guó)糖尿病患者已經(jīng)超過(guò)9 000萬(wàn)人，約有1/3的患者會(huì)并發(fā)DN，正威脅著人們的健康[10]。DN在中醫(yī)歸屬“消渴”“水腫”“尿濁”等范疇，以氣陰兩虛為本，瘀血、痰濕為標(biāo)，治則應(yīng)補(bǔ)氣利水，活血化瘀。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察黃芪注射液對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡和NF-κB蛋白表達(dá)的影響及分析三者的關(guān)系，探討了黃芪注射液治療DN的機(jī)制。

注：A為低糖組，B為高糖組，C為高糖+2 μg/mL黃芪注射液組，D為高糖+20 μg/mL黃芪注射液組，E為高糖+200 μg/mL黃芪注射液組

圖1 各組培養(yǎng)48 h和72 h腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況

表2 各組培養(yǎng)不同時(shí)間NF-κB蛋白表達(dá)量比較

注：①與高糖組比較，P<0.05；②與高糖+200 μg/mL黃芪注射液組比較，P<0.05；③與高糖+20 μg/mL黃芪注射液組比較，P<0.05。

圖2 各組培養(yǎng)48 h NF-κB蛋白表達(dá)情況

圖3 各組培養(yǎng)72 h NF-κB蛋白表達(dá)情況

在DN的發(fā)展過(guò)程中，高血糖有重要的促進(jìn)作用，長(zhǎng)期的高血糖可導(dǎo)致腎組織和功能損害，從而加速腎衰竭的進(jìn)展。研究表明NF-κB主要以無(wú)活性形式表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，但腎小管上皮細(xì)胞在高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)NF-κB表達(dá)明顯增加且活性增強(qiáng)[11]。此外，高血糖還可通過(guò)多途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明高糖環(huán)境可促進(jìn)NF-κB蛋白表達(dá)及腎小管上皮細(xì)胞凋亡。

NF-κB參與機(jī)體的各種應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，其與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系，參與多種細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對(duì)細(xì)胞凋亡有雙向調(diào)節(jié)作用。在某些因素的刺激及特定的細(xì)胞中，NF-κB的活化有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，該作用可能是通過(guò)抑制抗凋亡基因?qū)崿F(xiàn)的。腎小管上皮細(xì)胞中NF-κB表達(dá)的增加與細(xì)胞凋亡是否有聯(lián)系尚不明確，本實(shí)驗(yàn)相關(guān)性結(jié)果表明兩者存在正相關(guān)，即NF-κB表達(dá)的增加可能使腎小管上皮細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制可能與NF-κB相關(guān)。

黃芪注射液的主要成分是黃芪甲甙，有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾利濕等作用，其聯(lián)合其他藥物治療DN療效顯著[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)48h和72h，高糖組細(xì)胞凋亡率及NF-κB蛋白表達(dá)量均明顯高于其他組，黃芪注射液能顯著減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡及NF-κB蛋白表達(dá)；黃芪注射液濃度與NF-κB蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)，細(xì)胞凋亡率與NF-κB蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。推測(cè)高糖可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)增加，而NF-κB能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞凋亡率增加，黃芪注射液可通過(guò)抑制NF-κB蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率，對(duì)腎小管上皮細(xì)胞起到保護(hù)作用。但黃芪注射液作為中藥提取物，對(duì)DN發(fā)病機(jī)制的作用為多靶點(diǎn)，其具體作用機(jī)制仍不清楚，還有待進(jìn)一步研究。