急性感染性腹瀉沙門菌分離株的耐藥譜及其相關(guān)基因分析

張景皓，楊 峰，方 毅，楊麗華，劉文健，趙 虎，張艷梅

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040；2.上海市松江區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 201620）

急性感染性腹瀉是臨床常見的腸道感染性疾病之一，在我國具有較高的發(fā)病率[1]。導(dǎo)致急性感染性腹瀉的病原菌種類較多，包括各種腸道病原菌、腸道病毒和部分真菌及原蟲等。沙門菌是導(dǎo)致人類食源性急性腹瀉最常見的病原菌[2-3]。由于急性感染性腹瀉發(fā)病快，多數(shù)患者病程較短，而細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，所以臨床上多以經(jīng)驗(yàn)用藥為主，導(dǎo)致耐藥菌株增加、療效差和腸道微生態(tài)失衡，進(jìn)而引發(fā)多種并發(fā)癥[1，4]。有研究發(fā)現(xiàn)，沙門菌攜帶的耐藥基因中，β-內(nèi)酰胺酶類耐藥以blaTEM-1為主，喹諾酮耐藥主要由gyrA和parC點(diǎn)突變引起[5-6]，磺胺類耐藥基因是sulⅠ[7]，而aph（3）-Ⅱa是氨基糖苷類耐藥基因的代表之一[8]。本研究分析了分離自400例急性感染性腹瀉患者糞便樣本的22株沙門菌，檢測(cè)其藥物敏感性及相關(guān)耐藥基因的攜帶情況，以了解地區(qū)差異，為臨床的精準(zhǔn)診療提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2016年5月—2017年4月華東醫(yī)院急性感染性腹瀉患者糞便樣本52例、上海市松江區(qū)疾病預(yù)防控制中心急性感染性腹瀉患者糞便樣本348例，共400例。

1.2 儀器與試劑

Vitek MS 儀、Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）及配套藥敏板條，環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢呋辛、頭孢西丁和頭孢噻肟E-test試劑條購自英國Oxoid公司。血瓊脂平板、SS平板和M-H平板購自上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司。沙門菌血清學(xué)分型采用丹麥SSI公司生產(chǎn)的鑒定血清。校準(zhǔn)菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）由法國生物梅里埃公司提供，質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922、ATCC3 5218）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供。TIANamp Bacteria DNA Ki購自天根生化科技（北京）有限公司，Veriti 96 PCR儀購自美國ABI公司，引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 挑取糞便樣本，接種于SS平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，直至形成中等大小、透明或半透明可疑菌落。

1.3.2 菌種鑒定 采用Vitek MS 儀進(jìn)行菌種檢測(cè)。挑取單個(gè)菌落均勻涂布于靶板上，加入1 uL基質(zhì)（α氰基-4-羥基肉桂酸），室溫干燥后上機(jī)檢測(cè)。嚴(yán)格按照儀器說明書進(jìn)行操作。鑒定結(jié)果可信度均為99.9%。

1.3.3 血清學(xué)分型 將分離培養(yǎng)陽性的沙門菌轉(zhuǎn)種于血平板進(jìn)行分純和傳代培養(yǎng)。血清凝集實(shí)驗(yàn)的操作按照如下步驟進(jìn)行：懸空滴加1滴抗血清于載玻片上，用冷卻后的滅菌接種環(huán)挑取適量生長(zhǎng)狀態(tài)良好的待檢細(xì)菌，均勻涂布在抗血清中，小幅度晃動(dòng)載玻片，1 min內(nèi)觀察是否有凝集出現(xiàn)。血清凝集順序?yàn)閺亩鄡r(jià)到單價(jià)，從常見血清型到少見血清型。

1.3.4 藥物敏感性試驗(yàn) 采用Vitek 2 Compact藥敏板條，并補(bǔ)充5種臨床常用抗菌藥物（環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢呋辛、頭孢西丁和頭孢噻肟）E-test試劑條進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)2016 年版判讀標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果[9]。

1.3.5 相關(guān)耐藥基因檢測(cè) 采用檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM-1、blaCMY-2、blaPSE-1，磺胺類耐藥基因sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ，氨基糖苷類耐藥基因aph（3'）-Ⅱ a、aadA1、aadB、strB，喹諾酮類耐藥基因qyrA、qnrB、parC。目的基因引物序列和目的片段長(zhǎng)度見表1。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積25 μL，2xTaq PCR Master Mix 12.5 μL，正、反向引物各1 μL，模板2 μL，最后用ddH2O補(bǔ)至總體積25 μL[8]。

表1 耐藥基因引物序列和目的片段長(zhǎng)度

2 結(jié)果

2.1 沙門菌分離率和血清分型

剔除了分離自同一患者的重復(fù)菌株，從400例糞便樣本中分離到22株沙門菌，陽性分離率為5.5%。對(duì)22株沙門菌進(jìn)行血清學(xué)分型檢測(cè)，檢出率最高的血清型依次為鼠傷寒沙門菌（36.4%，8/22）、腸炎沙門菌（27.3%，6/22）和倫敦沙門菌（18.2%，4/22），德比沙門菌、湯普森沙門菌、紐波特沙門菌和吉偉沙門菌各檢出1株（4.5%，1/22）。

2.2 體外藥物敏感性試驗(yàn)

沙門菌整體耐藥率較高，其中氨芐西林-舒巴坦最高（95.5%），以下依次為氨芐西林、左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星-頭孢噻肟-慶大霉素、頭孢唑林-頭孢呋辛-頭孢他啶、阿米卡星。雖然環(huán)丙沙星較左氧氟沙星耐藥率低，但其中介率可達(dá)63.6%。哌拉西林-他唑巴坦、亞胺培南敏感率100%。見表2。

對(duì)不同血清型沙門菌耐藥情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，不同血清型沙門菌的耐藥情況分布較均一，兩者間并未出現(xiàn)明顯的相關(guān)性。

表2 沙門菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 [例（%）]

2.3 相關(guān)耐藥基因的檢測(cè)

β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM-1和DHA僅在耐藥菌株中被檢測(cè)到，檢出率均為23.8%（5/21），blaCTX-M1、blaCTX-M2、 blaCTX-M8、blaCTX-M9、blaSHV、blaCMY-2和blaPSE-1基因在所有菌株中均未被檢測(cè)到。磺胺類耐藥基因sulⅠ和sulⅢ僅在耐藥株中被檢測(cè)到，檢出率分別為66.7%（4/6）和16.7%（1/6），而sul Ⅱ基因僅在敏感株中被檢測(cè)到，檢出率為6.25%（1/16）。氨基糖苷類耐藥基因aadA1在耐藥株中的檢出率為25%（1/4），aph（3'）-Ⅱa、aadA1、aadB和strB基因未在耐藥菌株中被檢測(cè)到，但在敏感株中檢出率分別為5.6%（1/18）、22.2%（4/18）、5.6%（1/18）和50.0%（9/18）。喹諾酮類耐藥基因qyrA、qnrB、parC和qnrS均只在耐藥株中被檢測(cè)到，檢出率分別為47.1%、11.7%、58.8%和17.6%；qnrA在耐藥菌株中的檢出率為5.9%，其在敏感菌株中也被檢出1例；qnrC未被檢出。見表3。

表3 沙門菌耐藥基因測(cè)序結(jié)果及檢出率

3 討論

本研究從收集到的400例臨床糞便樣本中分離出22株沙門菌，分離率為5.5%，同其他地區(qū)報(bào)道的沙門菌分離率基本一致[11]。目前臨床多將喹諾酮類藥物作為對(duì)細(xì)菌感染性腹瀉經(jīng)驗(yàn)用藥的首選抗菌藥物，將磺胺類藥物作為次選藥物[1，12]。然而本研究通過對(duì)22株分離自急性感染性腹瀉患者糞便樣本中的沙門菌進(jìn)行15種臨床常用抗菌藥物的藥物敏感性試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，沙門菌對(duì)氨芐西林-舒巴坦、氨芐西林和左氧氟沙星的耐藥率分別高達(dá)95.5%、81.8%和77.3%，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑及慶大霉素的耐藥率也高達(dá)27.3%和18.2%，與國內(nèi)其他報(bào)導(dǎo)有較大的差異[5，7，13]。提示在臨床用藥時(shí)應(yīng)注意本地區(qū)沙門菌的耐藥譜，并進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)和分析，同時(shí)建議各地建立自己的耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)，以指導(dǎo)臨床用藥。

β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的主要作用機(jī)制為結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)膜上的靶位蛋白，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成[14]。當(dāng)細(xì)菌產(chǎn)生 β-內(nèi)酰胺酶后，可使 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物水解失活。β-內(nèi)酰胺酶分為 4 種類型，其中Ⅱ型酶是由質(zhì)粒介導(dǎo)的，包括TEM、OXA、CMY 等[7]。本研究β-內(nèi)酰胺類的耐藥基因中只測(cè)出blaTEM-1和DHA基因，陽性率均為23.8%（5/21），而blaCTX-M1、blaCTX-M2、blaCTX-M8、 blaCTX-M9、blaSHV、blaCMY-2和blaPSE-1基因在所有菌株中均未被檢測(cè)到，與國內(nèi)其他報(bào)道在耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物沙門菌株TEM攜帶率較高一致[5，13]。

氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥機(jī)制主要是氨基糖苷類鈍化酶的產(chǎn)生使氨基糖苷類抗菌藥物對(duì)菌株無法發(fā)揮作用，同一種抗菌藥物因藥物的分子結(jié)構(gòu)中可能存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)又可被多種鈍化酶所鈍化，有報(bào)道指出傷寒沙門菌以AAC（3）Ⅱ?yàn)橹鱗15]。本研究中，氨基糖苷類抗菌藥物耐藥株攜帶鈍化酶aadA1基因檢出率為25%（1/4），而且在敏感菌株中也有相當(dāng)高的攜帶率，提示還有其他耐藥機(jī)制影響其耐藥表型，如抗菌藥物的作用靶位改變、細(xì)胞壁通透性改變或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)異常等[15-16]。

喹諾酮類抗菌藥物耐藥機(jī)制主要是其作用于DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶，其亞單位分別由gyrA、gyrB和parC、parE基因編碼[15]。沙門菌中g(shù)yrA基因是氟喹諾酮類藥物的最初靶位，位于gyrA蛋白第67和106位氨基酸殘基之間，喹諾酮耐藥決定區(qū)中經(jīng)常突變而引起對(duì)氟喹諾酮類藥物的抗性；parC基因是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ編碼基因，也可能是喹諾酮類藥物的作用靶位，parC中第57位、第80位突變均可引起抗性產(chǎn)生[17]。 本研究結(jié)果表明沙門菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率較高，其基因攜帶率qyrA4為47.1%（8/17）、parC為58.8%（10/17）、qnrC為17.6%（3/17），qnrB為11.7%（2/17），而敏感菌株均未被測(cè)出，提示qyrA4、parC、qnrC和qnrB基因仍是喹諾酮類抗菌藥物的主要耐藥機(jī)制。

二氫蝶呤氨苯甲酸合成酶是細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的葉酸生物合成途徑中的一部分，磺胺可與二氫蝶呤氨苯甲酸合成酶相互作用，從而阻止細(xì)菌葉酸的合成，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。細(xì)菌編碼二氫蝶酸合成酶的耐藥基因有sul Ⅰ、sulⅡ、sul Ⅲ3種[15]，本研究結(jié)果顯示，磺胺類耐藥菌株主要攜帶sul Ⅰ基因[66.7%（4/6）]，其次為sul Ⅲ基因[16.7%，（1/6）]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在18株對(duì)氨基糖苷類敏感的菌株中，有15株分別攜帶有aph（3'）-Ⅱ a基因[5.6%，（1/18）]、aadA1基因[22.2%，（4/18）]、aadB基因[5.6%，（1/18）]和strB基因[50.0%，（9/18）]。同時(shí)，在16株對(duì)磺胺類敏感的菌株中，有1株攜帶sul Ⅱ基因[6.25%，（1/16）]。以上結(jié)果提示這些耐藥相關(guān)基因可能不是獨(dú)立發(fā)揮耐藥作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示上海地區(qū)沙門菌的主要血清型為腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌，而且其耐藥狀況嚴(yán)重，耐藥機(jī)制復(fù)雜，很多機(jī)制還有待于深入研究。同時(shí)，不同地區(qū)耐藥情況也有所差異，提示臨床應(yīng)該根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行精準(zhǔn)的診斷和治療。