外泌體在腫瘤疾病診斷中的研究進展

王 琪， 王保龍

（安徽醫科大學附屬省立醫院檢驗科，安徽 合肥 230000）

外泌體是由細胞主動分泌的大小均一、直徑為40～100 nm的脂質雙分子層結構小囊泡[1]。外泌體的發現至今已有30多年的歷史，最初是由JOHNSTONE等[2]發現的羊成熟網織紅細胞釋放的一種膜性小囊泡。此后的研究結果顯示，外泌體可由樹突細胞、淋巴細胞、血小板、肥大細胞 、內皮細胞 、成纖維細胞 、間充質干細胞和腫瘤細胞等不同類型細胞的脫落釋放，而且其廣泛分布于各種體液中，如血液、尿液、唾液、腦脊液、乳汁、羊水、腹水等[3]。學者們最初認為外泌體發揮類似細胞垃圾袋的作用，將細胞不需要的物質運輸出細胞。而近年來發現，外泌體是具有功能活性并可進行細胞間信息傳遞的分泌微囊泡，這種納米級膜泡中含有受體、生物活性脂類物質、蛋白質和重要遺傳物質如mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）及片段化DNA等組分，參與細胞通訊、細胞遷移、血管新生、免疫反應和腫瘤細胞生長等過程[4]。

近年來，外泌體作為疾病診斷的生物標志物已逐漸成為研究熱點。外泌體作為細胞間通訊信息交換的生物載體，在國內外已開展了細胞間信號轉導、腫瘤診斷及靶向治療等領域的研究。越來越多的研究結果顯示，外泌體與腫瘤有著密不可分的關系，外泌體參與了腫瘤發生、發展的很多過程，包括腫瘤轉移及血管新生、抗腫瘤免疫、腫瘤免疫逃逸等[5]。腫瘤在生長過程中會不斷地將外泌體釋放到周圍環境中，在體內有較長的半衰期，且易于從體液中分離，而且外泌體內含有腫瘤細胞來源相關的多種蛋白質、脂類和核酸，因此也可作為生物標志物用于腫瘤的輔助診斷、療效評價以及預后監測等[6]。另外，糖尿病、人類免疫缺陷綜合征、慢性炎癥疾病、心血管疾病、神經系統疾病及自身免疫性疾病患者細胞外囊泡水平均升高[7]，因此外泌體也有望成為診斷這類疾病的生物標志物，具有廣闊的臨床應用前景。

腫瘤是威脅人類健康和生存最主要的疾病之一，早期發現難、治愈率低、預后差。腫瘤的早期診斷能夠降低患者死亡率。然而，目前臨床上尚缺乏有效的早期診斷方法，亟需尋找可以應用于腫瘤早期診斷的生物標志物[8]。隨著相關技術的不斷進步，越來越多的研究者將目光投向了外泌體在腫瘤發生、發展中的作用及其臨床應用。外泌體內容物繁多且復雜。目前，ExoCarta數據庫收錄了11 261種蛋白、194種脂類、2 375種mRNA和764種miRNA[9]。外泌體在所有類型的體液中均可被檢測到，腫瘤細胞可以比正常細胞分泌更多的外泌體進入體液中，且腫瘤外泌體的分子特征能部分反映來源腫瘤的表型，因此外泌體有成為新的腫瘤診斷標志物的潛力[10]。文章就外泌體在腫瘤診斷應用中的研究進展作一綜述。

1 外泌體核酸

腫瘤細胞分泌的外泌體中攜帶的miRNA、mRNA、長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）及DNA等核酸分子是最受關注的一類可作為腫瘤診斷生物標志物的分子。這些分子反映了分泌細胞的生理狀態和功能狀態，甚至還會包含細胞病態相關的分子信息，尤其是腫瘤細胞來源的外泌體含有的miRNA具有異質性，這就使得外泌體源性miRNA有可能成為腫瘤診斷的新指標[11]。近年來的研究結果顯示，腫瘤細胞分泌的外泌體中的DNA、mRNA及lncRNA可反映腫瘤患者的病理生理狀態及原發腫瘤的性質，有望作為診斷腫瘤的指標[12]。

1.1 呼吸系統腫瘤

CAZZOLI等[13]對肺腺癌患者、肺肉芽腫患者、健康吸煙者的研究結果顯示，血漿外泌體中的4種miRNA（miRNA-378a、miRNA-379、 miRNA-139-5p和miRNA-200b-5p）可用于肺癌的篩查，另6種miRNA（miRNA-151a-5p、miRNA-30a-3p、miRNA-200b-5p、miRNA-629、miRNA-100和miRNA-154-3p）可用于肺癌的診斷。SILVA等[14]的研究結果顯示非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）外泌體中的 miRNA 表達譜與正常組織存在差異，其中let7f 和miRNA-30e-3p的表達水平可區分早期和晚期 NSCLC患者，并且二者表達水平與患者較差的預后有關。由此可見，循環外泌體源性miRNA或可作為肺癌早期診斷的非侵入性生物標志物。

1.2 消化系統腫瘤

惡性食管鱗狀細胞癌患者外泌體miRNA-21顯著高于良性反流性食管炎患者，外泌體miRNA-21的高表達往往預示著癌細胞的廣泛浸潤和癌癥復發[15]。MADHAVAN等[16]的研究結果顯示胰腺癌患者外泌體中4種miRNA（miRNA-1246、miRNA-4644、miRNA-3976和miRNA-4306）呈特異性高表達，而正常對照者則很少表達。OGATA-KAWATA等[17]的研究結果顯示原發性大腸癌患者有7種miRNA（let-7a、miRNA-1229、miRNA-1246、miRNA-150、miRNA-21、miRNA-223和miRNA-23a）的表達顯著高于健康對照者。WANG等[18]的研究結果顯示，結直腸癌患者血清環狀RNA（circular RNA，circRNA）與正常對照者比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示循環血液中的circRNA對腫瘤具有重要的診斷價值。張云等[19]的研究結果顯示，血清外泌體來源的miRNA-122診斷肝癌的敏感性為81.93%、特異性為82.05%，提示外泌體源性的miRNA-122可作為一種新的腫瘤標志物用于原發性肝癌的早期診斷。另外，肝癌細胞來源的外泌體攜帶的lncRNA TUC339 明顯升高，也可用于肝癌的診斷[20]。LI等[21]的研究結果顯示，胃癌患者血液中的lncRNA LINC00152 主要富集在外泌體中，可促進胃癌進展，也可用于胃癌的診斷。由此可見，外泌體在消化系統腫瘤中具有重要的臨床價值，應用前景廣闊。

1.3 泌尿系統腫瘤

BRYANT等[22]通過分析前列腺癌患者和正常對照者血液和尿液的外泌體，發現miRNA-141和miRNA-375或可作為診斷前列腺癌的生物標志物。MOTAMEDINIA等[23]的研究結果顯示尿液中外泌體的mRNA可用于鑒別前列腺癌和良性增生性疾病，尿液中外泌體的基因檢測可代替病理活檢來鑒別前列腺癌及單純前列腺特異性抗原升高的疾病。LONG等[24]采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）芯片對膀胱移行細胞癌患者和健康對照者外泌體中的236種miRNA進行分析，其中7種miRNA表達有差異，這7種miRNA診斷膀胱移行細胞癌的敏感性和特異性分別為88%和78%，提示miRNA可作為膀胱癌的診斷標志物。

1.4 生殖系統腫瘤

TAYLOR等[25]的研究結果顯示，卵巢癌患者與正常人血液中外泌體的miRNA圖譜有明顯差異，卵巢癌患者血清中的外泌體中有8種miRNA表達顯著升高，提示外泌體有助于卵巢癌的診斷。HANNAFON等[26]發現，乳腺癌患者血漿中外泌體miRNA-1246 和miRNA-21表達顯著高于健康對照者（P值分別為0.03、0.04），表明外泌體中的miRNA可用于生殖系統腫瘤的診斷。

1.5 其他腫瘤

在其他系統腫瘤的研究中，MANTEROLA等[27]對比了惡性腦膠質母細胞瘤患者及正常對照者的血清外泌體，利用基因芯片技術篩選出表達差異最大的miRNA-574-3P、miRNA-320及RNU6-1，同時證實RNU6-1單獨或多個miRNA聯合可特異性地診斷惡性膠質母細胞瘤。ROCCARO等[28]的研究結果顯示，miRNA-15a在多發性骨髓瘤患者骨髓間充質干細胞的外泌體中的表達明顯下調，與多發性骨髓瘤的特性密切相關。

存在于循環外泌體中的核酸分子具有作為腫瘤早期診斷標志物的潛力，雖然具體作用機制還有待深入研究，但其在各種腫瘤的臨床診斷中已表現出巨大的潛力。越來越多的研究者正致力于在循環體液中放大這種分子，使其變為診斷工具，從而促進腫瘤液體活檢的發展，為腫瘤的早期診斷打開了一扇新的大門。

2 外泌體蛋白質

外泌體中的蛋白質成分復雜，大體可分為2類：一類是外泌體中普遍含有，參與其結構形成的蛋白質；另一類是與細胞來源有關的蛋白質，如腫瘤細胞產生的外泌體中人凋亡相關因子配體（human factor-related apoptosis ligand，FasL）、腫瘤壞死因子凋亡相關配體（tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand，TRAIL）和轉化生長因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）等腫瘤抗原和免疫抑制蛋白[29]，這使得外泌體在腫瘤及相關疾病的診斷中具有重要的潛在價值。

2.1 外周血中與腫瘤相關的外泌體蛋白標志物

LI等[30]的研究結果顯示，胃癌細胞高表達CD97，可調節腫瘤細胞的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，促進腫瘤細胞的增殖與侵襲。因此，外泌CD97或可作為一種有潛在價值的胃癌診斷指標。與正常人相比，胃癌患者血液外泌體中人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）、人趨化因子受體6（human chemokine receptor 6，CCR6）的表達會明顯升高[31]。眾多腫瘤的外周血外泌體中多種蛋白存在異常表達。見表1。

表1 外周血中與腫瘤相關的外泌體蛋白標志物

2.2 尿液中外泌體在腫瘤診斷中的研究進展

尿液樣本不僅容易獲得，而且收集簡便、無創、數量大。因此，尿液中外泌體的檢測對于泌尿系統腫瘤的早期診斷、預后判斷等無疑是個福音。NILSSON等[37]的研究結果顯示前列腺癌患者尿液外泌體中可檢測到跨膜蛋白酶、絲氨酸2-ETS基因、β-連環蛋白和前列腺癌抗原3等前列腺癌相關的分子。BECKHAM等[38]通過抽提尿液外泌體發現，膀胱癌患者外泌體中表皮生長因子樣重復折疊1結構域蛋白3抗體（epidermal growth factor-like repeats and discoidin 1-like domains-containing protein 3，EDIL3）水平遠高于正常人，可作為膀胱癌早期診斷和良好預后的標志物。

3 其他體液中的外泌體在腫瘤診斷中的研究進展

除外周血和尿液外，胸水、腹水、唾液、乳汁等體液中的外泌體也具有診斷相應組織器官腫瘤的潛力，而且比血液、尿液中的外泌體有更強的器官特異性[39]。YANG等[40]的研究結果顯示唾液囊泡中的 hCD63 mRNA和GAPDH mRNA 有助于輔助診斷肺癌。WELTON等[41]在研究腦膠質瘤細胞時發現外泌體攜帶的 miRNA-19a 可靶向腫瘤細胞內的第10號染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 ，PTEN）mRNA，從而影響腫瘤細胞內PTEN蛋白的表達，促進腫瘤腦轉移。SHIMODA等[42]的研究結果顯示，組織金屬蛋白酶抑制劑可以減少腫瘤基質細胞釋放促進腫瘤生長的外泌體，這類細胞釋放的外泌體可以提高乳腺癌細胞的運動性。此外，胃癌患者腹水中外泌體表達的CD63、癌胚抗原、FasL、TraiL等也有作為胃癌生物標志物的潛力。除上述體液外，肺泡灌洗液、卵泡液中也發現了外泌體，在腫瘤、生殖功能、呼吸功能的診斷中有重要價值[43]。

4 結語和展望

外泌體是一類攜帶多種有生物學活性物質的膜性囊泡，可作為一種無創或微創的非侵入性疾病診斷手段，在一定條件下能代替組織活檢，以減輕患者的痛苦，提高疾病早期診斷率。腫瘤源性外泌體作為一種新的腫瘤標志物，在腫瘤的早期診斷、疾病監測及預后評估中有著較好的應用前景。另外，外泌體在心血管疾病、感染性疾病等非腫瘤疾病中的應用也頗受關注。目前，外泌體中作為疾病診斷生物標志物的物質主要是核酸和蛋白質，在后續研究中脂質等也有望成為疾病診斷的生物標志物。然而，外泌體的分離技術目前還不夠完善，難以得到純度較高的外泌體，對后續的檢測和分析造成了一定的困難；而且外泌體的檢測系統也尚未成熟，難以滿足臨床大樣本量的檢測。因此，如何在各種體液中檢測到疾病特異性的外泌體生物標志物將是今后努力探索的目標之一。總之，外泌體作為疾病診斷的生物標志物仍處于早期研究階段，要應用于臨床診斷還有很長的一段路要走。

外泌體除了有作為生物標志物的巨大潛力外，還為腫瘤的精準治療提供了新的研究方向。目前，外泌體的應用開始進入不同的臨床試驗階段，一些基于外泌體的臨床研究方案也已逐步建立。在非小細胞肺癌患者負載自體樹突狀細胞外泌體的接種試驗中，有9例患者已完成疫苗治療；基于樹突狀細胞釋放的外泌體治療晚期腫瘤患者的方案安全可行[44]。外泌體在疾病診斷和治療中的應用前景廣闊，但如何實現其在臨床上的應用價值仍需研究者們的共同努力。