急性髓性白血病患者淋巴細胞中CD39+CD4+CD25+T細胞比例與預后的相關性

章梁君， 鐘輝秀， 楊新春

（自貢市第一人民醫院檢驗科，四川 自貢 643000）

急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種原始細胞在骨髓中快速增殖的高度異質性疾病[1]。在我國，AML的總體發病率為2.76例/10萬人[2]，且有逐漸增高的趨勢。AML的發病機制目前尚不完全明確，骨髓微環境可能在AML的發生、發展中起重要作用。白血病細胞會產生許多免疫抑制因子，導致腫瘤的生長難以控制[3]。有研究結果顯示，CD4+CD25+調節性T細胞在保持自身耐受和調節生理、病理狀態的免疫應答方面起重要作用[4]。還有研究結果顯示，非小細胞肺癌、卵巢癌、胃癌和急性白血病患者外周血CD39+CD4+CD25+T細胞比例顯著升高[5-6]。CD4+CD25+T細胞的不同亞群通過不同的機制在免疫抑制中起不同的作用。CD39作為免疫抑制因子中非常重要的分子，可將細胞外的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水解成腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）和腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP），并通過這些水解產物發揮免疫抑制作用。免疫性疾病和腫瘤患者，尤其是慢性淋巴細胞性白血病患者CD4+CD25+T細胞CD39表達增加[7]。目前，尚未見CD39+CD4+CD25+T細胞比例在AML中的潛在功能及其與AML臨床特征和進展關系的報道。為此，本研究擬探討AML患者CD39+CD4+CD25+T細胞比例與AML臨床特征的相關性及其在疾病過程中的變化。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年1月—2015年12月自貢市第一人民醫院確診的、未經治療的AML患者157例，其中男84例、女73例，年齡（45±16）歲，根據法美英（French-American-British，FAB）形態學分型標準及2008年世界衛生組織（World Health Organization，WHO）造血和淋巴組織腫瘤分類標準中的免疫表型標準，將患者分為AML-M1組（23例）、AML-M2組（40例）、AML-M3組（25例）、AML-M4組（37例）和AML-M5組（32例）5個亞組。排除已治療患者、伴有其他腫瘤患者、自身免疫性疾病患者、病毒感染患者、混合型白血病患者及慢性白血病急性轉化患者。另選取同期自貢市第一人民醫院體檢健康者41名作為正常對照組，其中男23名、女18名，年齡（48±11）歲。AML患者和正常對照者性別、年齡差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究經自貢市第一人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

采集所有研究對象靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。收集AML患者的臨床特征（年齡、性別）和各項檢查[血常規、骨髓報告中原始細胞比例、骨髓免疫表型、胸腹部B超、電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）或磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、腦脊液檢查]結果。白血病的髓外浸潤定義為骨髓以外的其他組織或臟器發現有白血病細胞浸潤的證據。髓外浸潤的判定標準基于CT或MRI及腦脊液檢查結果。

1.3 流式細胞術分析

取CD45-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）（美國Beckman-Coulter公司）、CD39-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）（美國eBioscinece公司）、CD4-藻紅蛋白花青苷5（phycoerythrin cyanin 5，PC5）（美國Beckman-Coulter公司）和CD25-藻紅蛋白德州紅（energy coupled dye，ECD）（美國Beckman-Coulter公司）抗體各10 μL，連同種型對照抗體一并加入到100 μL全血中，在室溫、黑暗環境中孵育15 min。加入2 mL 1×紅細胞（red blood cell，RBC）裂解緩沖液（美國Beckman-Coulter公司）裂解RBC。用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌細胞2次。通過EPICS XL流式細胞儀（美國Beckman-Coulter公司）獲得至少10 000個細胞并進行分析。使用相應的同種型對照抗體門控陰性細胞。采用EXPO32 ADC XL4和EXPO32 ADC分析軟件分析結果。根據形態學參數[CD45/側向角散射（side scatter，SSC）]篩選淋巴細胞群。計算淋巴細胞中CD3+CD4+CD25+CD39+T細胞的百分比。根據CD39+CD4+CD25+T細胞占淋巴細胞的比例將AML患者分為3組：低水平組（CD39+CD4+CD25+T細胞＜5%，35例）、中水平組（CD39+CD4+CD25+T細胞為5%～10%，60例）和高水平組（CD39+CD4+CD25+T細胞 ＞10%，62例）。為排除CD4+CD25+T細胞比例對CD39+CD4+CD25+T細胞比例的影響，根據CD4+CD25+T細胞比例將AML患者分為低水平組（CD4+CD25+T細胞＜8.8%，35例）、中水平組（CD4+CD25+T細胞為8.8%～14.9%，60例）和高水平組（CD4+CD25+T細胞＞14.9%，62例），分析3組髓外浸潤及CD34、CD7的表達情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以x ±s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。呈非正態分布的數據以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，采用Cruskal-Wallis秩和檢驗。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。繪制Kaplan-Meier曲線表示化療緩解持續時間。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AML組與正常對照組CD39+CD4+CD25+T細胞比例的比較

AML組及各亞組CD39+CD4+CD25+T細胞比例均明顯高于正常對照組（P＜0.05），其中AML-M2組CD39+CD4+CD25+T細胞比例最高（12.85%），AML-M1組最低（5.51%）。AML組與正常對照組之間CD4+CD25+T細胞比例差異無統計學意義（P＞0.05），但AML-M1患者明顯低于正常對照者（P＜0.05）、AML-M2患者明顯高于正常對照者（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 AML組與正常對照組CD4+CD25+T細胞比例和CD39+CD4+CD25+T細胞比例的比較 （%，x±s）

圖1 正常對照組及AML各亞組CD39+CD4+CD25+T細胞比例的分布

2.2 不同CD39+CD4+CD25+T細胞和CD4+ CD25+T細胞水平組AML患者各項檢查結果的比較

CD39+CD4+CD25+T細胞低水平組、中水平組和高水平組髓外浸潤比例及骨髓原始細胞CD34、CD7陽性率依次升高，各組間差異有統計學意義（P＜0.05）。RBC計數、白細胞（white blood cell，WBC）計數、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、血小板（platelet，PLT）計數、肝脾腫大患者比例、骨髓原始細胞比例和原始細胞表達人類白細胞抗原-DR（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）、CD56、CD19的比例3組之間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

CD4+CD25+T細胞低水平組、中水平組和高水平組之間髓外浸潤比例及CD34、CD7陽性率差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表2 CD39+CD4+CD25+T細胞低水平組、中水平組、高水平組各項檢查結果的比較

表3 CD4+CD25+T細胞低水平組、中水平組和高水平組各項指標的比較

2.3 CD39+CD4+CD25+T細胞比例和CD4+CD25+T細胞比例與化療間隔時間的關系

157例AML患者中有33例接受DA（柔紅霉素和阿糖胞苷）標準化療，包括5例AML-M1患者、7例AML-M2患者、12例AML-M4患者和9例AML-M5患者。本研究記錄患者1年中的下次治療時間（time to next treatment，TTT），即從首次活動性發病治療開始到下一次治療之間的間隔時間。與CD39+CD4+CD25+T細胞低水平組比較，中水平組和高水平組TTT較短（P＜0.05）。CD4+CD25+T細胞低水平組、中水平組和高水平組之間TTT差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、圖3。

圖2 不同CD39+CD4+CD25+T細胞比例AML患者的Kaplan-Meier曲線

圖3 不同CD4+CD25+T細胞比例AML患者的Kaplan-Meier曲線

3 討論

CD39作為多個細胞表面的關鍵酶，可將細胞外的核苷三磷酸（nucleoside triphosphate，NTP）分解成核苷二磷酸（nucleoside diphosphate，NDP）和核苷一磷酸（nucleoside monophosphate，NMP）。核苷酸的分解代謝產物可能對多種生理、病理過程產生影響，如血液凝固、血管生成、炎癥、免疫、增殖和凋亡。有研究結果顯示，CD4+CD25+T細胞上表達的CD39可將ATP分解為腺苷，CD39是能抑制免疫反應活性的物質[8]。AML是一種惡性血液病，其白血病細胞產生的免疫抑制因子可導致腫瘤生長失控[3]。CD39+CD4+CD25+T細胞可誘導抗腫瘤免疫反應減弱，使疾病進一步惡化[9]，其免疫抑制作用部分歸因于胞外水解酶CD39水解ATP的重要作用[10]。

本研究結果顯示，AML組CD4+CD25+T細胞比例與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），而CD39+CD4+CD25+T細胞比例明顯高于正常對照組（P＜0.05）。AML-M1患者CD4+CD25+T細胞比例明顯低于正常對照者（P＜0.05），而CD39+CD4+CD25+T細胞比例則明顯高于正常對照者（P＜0.05），說明AML-M1患者CD39+比例升高最為明顯。AML-M2患者CD4+CD25+T細胞比例和CD39+CD4+CD25+T細胞比例均明顯高于正常對照者，因此不排除CD39+的升高是由CD4+CD25+T細胞比例升高所致。DULPHY等[11]的研究結果顯示，與正常對照者相比，AML患者CD4+T細胞中CD39+T細胞比例更高，與本研究結果一致。還有研究結果顯示，各種實體腫瘤如頭頸腫瘤、結腸癌直腸癌、肝癌和胃癌，特別是慢性淋巴細胞白血病，其臨床分期與CD39水平相關，患者的CD39表達水平明顯升高[12-13]。

調節性T細胞是CD4+T細胞的重要亞群，其在維持免疫系統的體內平衡和對抗外來抗原的過度免疫應答中起至關重要的作用。在腫瘤微環境中，CD39+CD4+CD25+T細胞主要通過多個表面分子、細胞接觸依賴和細胞因子分泌來介導免疫抑制反應。近年來，學者們已發現了CD39-CD73腺苷途徑的新作用。CD39是胞外核苷酸酶的級聯限速酶，其產生的腺苷可抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞的功能以及自然殺傷細胞的抗腫瘤活性[14]。本研究結果顯示，CD39+CD4+CD25+T細胞高水平組發生髓外浸潤比例較高，TTT更短；但CD4+CD25+T細胞低、中、高水平組之間髓外浸潤和TTT差異均無統計學意義（P＞0.05）。說明CD39+CD4+CD25+T細胞比例較高的AML患者病情更為嚴重，預后更差[7]。CD4+CD25+T細胞上的CD39表達或可作為AML患者的預后標志，但還需要進一步研究來證實。

此外，本研究結果還顯示骨髓中原始細胞表達CD34和CD7的AML患者CD39+CD4+CD25+T細胞比例更高。1989年，HAYNES等[15]從AML患者分離出白血病干細胞，證實只有表達CD34的白血病細胞才能形成集落，CD34可能是腫瘤干細胞的細胞表面標志物。本研究結果顯示，原始細胞CD34陽性組CD39+CD4+CD25+T細胞高水平組患者比例（72.58%）明顯高于CD34陰性組（27.42%）。有研究結果顯示，CD34可通過改變CD4+細胞的分子組成對免疫抑制反應產生影響[16]。因此，原始細胞表達CD34在改變CD4+淋巴細胞CD39表達中起著一定的作用。CD7是一種糖蛋白，是T細胞發育中的特征標志物之一，曾被證實在分化成T細胞、B細胞和髓細胞的多能造血干細胞中表達。有研究結果顯示，白血病細胞也可表達CD7和CD34[17]，說明CD7分子是一種早期分子標志物。本研究結果顯示，CD39+CD4+CD25+T細胞比例升高與細胞發育階段可能存在聯系，但仍需進一步研究證實。同時，CD7和CD34也是AML患者預后差的標志物[18]。因此，CD39+CD4+CD25+T細胞比例可能與AML預后有關。

總之，AML患者CD39+T細胞比例明顯增高，可能與AML患者髓外浸潤、CD34陽性率、CD7陽性率及預后有關。由此可見，AML患者CD39+T細胞比例增高可能是白血病細胞的重要免疫逃逸機制。CD39或可作為AML疾病發展的新標志物和新治療靶點。