7種國產沙眼衣原體核酸檢測試劑的平行比較

陳 凱， 韓 燕， 尹躍平， 鐘銘英， 朱邦勇， 施美琴

[1. 中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病醫院（研究所）中國疾病預防控制中心性病控制中心參比實驗室，江蘇 南京 210042；2. 廣西壯族自治區皮膚病防治研究所，廣西 南寧 530003]

沙眼衣原體引起的泌尿生殖道感染是全球范圍內最為常見的性傳播疾病之一。2008年，世界衛生組織估計每年新發感染的病例達1.3億例[1]，沙眼依原體感染可導致尿道炎、子宮頸炎或盆腔炎等。如果感染者未能得到及時的診治，會導致沙眼衣原體持續傳播并可能引起繼發的后遺癥，如盆腔炎、異位妊娠，甚至不孕癥。近70%的女性和50%的男性泌尿生殖道感染沙眼衣原體后臨床癥狀隱匿[2]，且與其他感染引起的癥狀相似，臨床醫生對沙眼衣原體感染的明確診斷主要依據實驗室的病原學檢測結果。目前，臨床診斷沙眼衣原體感染的方法主要包括：膠體金免疫層析法、酶聯免疫吸附試驗、培養法和核酸檢測法等，其中核酸檢測法在美國、歐洲等發達地區已經被推薦為沙眼衣原體檢測的首選方法[2-3]。

目前，美國食品藥品監督管理局共批準5家公司的商品化試劑用于泌尿生殖道沙眼衣原體感染的診斷。截至2018年6月，中國食品藥品監督管理局已批準28家單位生產沙眼衣原體的核酸診斷試劑，共29種產品。29種產品中采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）-熒光探針法的27種，采用PCR-膜雜交法的1種，采用RNA恒溫擴增法的1種。此外，我國許多實驗室也正在積極研制沙眼衣原體核酸檢測的方法[4]。我國利用核酸試劑診斷泌尿生殖道沙眼衣原體感染的醫療機構數量正逐年增加，但尚無關于市售核酸檢測試劑質量的報道。本研究采用臨床樣本對我國市售的部分使用頻率較高的沙眼衣原體核酸檢測試劑進行小樣本的平行評估，為臨床選擇沙眼衣原體核酸診斷試劑提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2016年10—12月在廣西壯族自治區玉林市皮膚病研究所性病門診就診的患者101例，其中男16例，女85例。采集每例患者2份拭子樣本，1份用于當地的檢測，1份保存在-80℃冰箱，通過冷鏈方式運送至中國疾病預防控制中心性病控制中心參比實驗室。本研究經中國醫學科學院皮膚病醫院（研究所）醫學倫理委員會審批通過。

1.2 參評試劑

我國目前共批準沙眼衣原體核酸診斷試劑29種，結合2013—2017年全國沙眼衣原體檢測質間質評反饋信息，最終選擇國內使用頻率較高、能夠應用LightCycler 480熒光定量PCR儀進行擴增檢測的7種核酸試劑，分別標為A、B、C、D、E、F、G試劑。

1.3 方法

1.3.1 定量樣本處理 （1）定量樣本制備。定量樣本為實驗室自制，由9例樣本組成，其中陽性樣本8例、陰性樣本1例。陰性樣本選用McCoy葡萄糖細胞保存液。陽性質控樣本的制備按照以下步驟進行：采用細胞培養法對沙眼衣原體參考菌株（E-Bour）進行擴大培養。培養物經裂解混勻后采用G試劑進行定量及均一性檢測。根據上述結果，將沙眼衣原體裂解后，純培養物利用G試劑進行定量，測定的濃度為5.0×108，吸取20 μL純培養物，用80 μL保存液進行稀釋，混勻后進行10倍等比例稀釋，共計8個濃度，稀釋后的純培養物再利用達安試劑進行定量檢測，以測定每個稀釋濃度下的純培養物濃度：101拷貝/mL～108拷貝/mL；分別將50 μL上述梯度稀釋的菌懸液滴加在拭子的纖維部位，置于37℃恒溫孵箱中干燥4 h，取出后置于 4℃冰箱備用。（2）定量樣本處理。所有定量樣本的DNA提取和擴增試驗均按照各試劑說明書的要求進行。根據試劑說明書檢測結果的解釋對檢測結果進行陰性、陽性的判定。利用定量試劑對10個同一濃度的弱陽性質控（104拷貝 / mL）進行重復性檢測，將檢測所得的循環時間帶入標準曲線后計算濃度，然后根據計算所得的濃度計算離散系數。

1.3.2 臨床樣本處理 （1）DNA提取。用生理鹽水洗脫所有臨床拭子樣本。采用Qiagen公司生產的QIAxtractor全自動核酸純化儀提取DNA，實驗操作按照說明書進行，每例樣本獲得200 μL DNA液，平均分為2份，保存于1.5 mL的凍存管中，放置于-20℃冰箱待用。（2）核酸擴增檢測。按照試劑說明書對101例臨床拭子樣本的DNA提取液進行核酸的擴增檢測。根據試劑說明書對檢測結果進行陰性、陽性的判定。

1.4 統計學方法

比較各試劑對質控品結果的吻合度，選擇吻合度最高的試劑作為此次試劑平行比較的參考試劑，計算各種不同檢測方法的特異性、靈敏性、“參考試劑”之間的一致性。采用McNemar χ2檢驗比較不同試劑對臨床樣本的檢測性能，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各試劑基本情況比較

試劑擴增檢測的時間為2～3 h，但C試劑擴增步驟較其他檢測試劑繁瑣，需要在PCR反應管中先加入核酸釋放劑及待測樣本后，再加入PCR混合液，然后離心。適宜樣本：7種試劑適用的樣本均為宮頸拭子和尿道拭子，未提及無創傷性樣本（尿液樣本）。擴增方法均以Taq酶水解熒光探針作為檢測探針。見表1。

表1 各試劑的基本情況比較[2]

2.2 定量樣本檢測結果

對照7種試劑的說明書進行陰性、陽性的判斷，所有試劑對9例樣本的檢測結果見表2。其中A試劑和B試劑在檢測濃度為101拷貝/mL的樣本時未能計算出Ct值；A試劑在檢測＜102拷貝/mL的樣本時、F試劑在檢測＜103拷貝/mL的樣本時、B試劑在檢測＜104拷貝/mL的樣本時Ct值超過了其陽性的評判標準。對照說明書的給出的檢測限，F試劑和B試劑檢測定量樣本并未達到其說明書所給出的檢測限。C試劑和F試劑檢測陰性樣本時能夠計算出Ct值，這2種試劑檢測陰性樣本時熒光定量曲線有翹尾，見圖1。對3種定量核酸試劑104拷貝/mL的樣本（含樣本處理過程）重復檢測10次后，C試劑、G試劑和F試劑的均數及變異系數分別是6.26×103拷貝/mL、3.56%，2.91×104拷貝/mL、1.46%和5.04×104拷貝/mL、2.60%。

綜合各檢測試劑對不同濃度定量樣本及定量試劑檢測的變異系數，最終擬選擇2種定性試劑（E試劑，D試劑）作為參考試劑。

表2 7種國產核酸檢測試劑檢測定量樣本的Ct值比較

圖1 G試劑、F試劑檢測陰性樣本熒光定量曲線

2.3 臨床樣本的檢測結果

E試劑和D試劑檢測101例臨床樣本的結果一致（18例陽性，83例陰性），其余5種試劑共有7例臨床樣本檢測結果與參考試劑不一致。其中450100-007、450100-055、450100-110及450100-194號樣本僅有1種試劑檢測出陽性，450100-003和450100-150號樣本有2種試劑出現了漏檢，見表3。5種核酸試劑與參考試劑檢測比較結果見表4。各試劑與參考試劑的性能差異沒有統計學意義（A試劑和G試劑與參考試劑比較χ2=0.00，P=1.000；C試劑與參考試劑比較χ2=0.00，P=1.000；F試劑與參考試劑比較χ2=0.25，P=0.617；B試劑與參考試劑比較χ2=0.50，P=0.479。

表3 7種核酸試劑與參考試劑檢測結果比較

表4 5種核酸試劑與參考試劑檢測結果的比較

3 討論

本研究對我國目前常用的沙眼衣原體核酸檢測試劑的檢測結果進行了平行比較。結果顯示：F試劑和B試劑在對定量樣本和臨床DNA樣本的檢測性能均較其他試劑的性能低，A試劑在檢測定量樣本時對低濃度樣本（101拷貝/mL）未能檢測出，E試劑和D試劑因對質控品檢測的性能較好被選為參考試劑，對臨床樣檢測的結果與其他半數以上的核酸試劑檢測結果一致，另外5種核酸試劑與參考試劑檢測結果比較后，敏感性為88.89%～100%，特異性為97.59%～100%，各試劑與參考試劑的檢測敏感性有一定的差異，但差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究評估的7種國產核酸試劑的特異性與趙廣錄等[6]報道的2種核酸試劑的特異性類似，均能達到95%以上，這與美國食品藥品監督管理局批準的5種沙眼衣原體核酸檢測試劑的特異性相當[7-9]。但是國產核酸試劑中部分試劑的敏感性尚未達到90%，與趙廣錄等[6]結果相似，因此這些試劑的生產廠商需要進一步提升產品敏感性。

生殖道沙眼衣原體感染可以通過檢測泌尿生殖道脫落的上皮細胞加以明確。脫落的上皮細胞不僅可以通過拭子采集，還可以通過尿液樣本檢測，檢測尿液樣本可以促進對無癥狀患者的篩查，同時還可以降低采集的成本[11]。此外也可進行多種試劑的平行評估。但此次參評的7種核酸檢測試劑均僅適用于男性尿道拭子和女性宮頸拭子樣本。因此檢測該類試劑在今后的研發中應關注對無創性樣本的檢測。

本研究選用了尿道和宮頸拭子的DNA樣本，對同一例樣本的DNA進行擴增性能比較，是對沙眼衣原體核酸檢測試劑擴增的效果進行的一次探索性評估，評估核酸檢測試劑擴增的性能及使用的可接受性。為了平行比較多種核酸檢測試劑的性能，本研究選用了國際認可的核酸提取試劑QIAxtractor全自動核酸純化儀對樣本的DNA進行了提取[12]，節省了對臨床樣本的需求。但不可否認的是，這種評估方式忽略了對核酸試劑中DNA提取的評估。此外，因無法使用部分試劑的內標物質，沒有分析試劑本身對陰性樣本的質控結果。

判讀實時PCR的檢測結果最為關鍵的是閾值的設定，閾值的設定通常是3～15個循環的熒光信號標準偏差的10倍。7種國產試劑多數的閾值設定能夠將陰性質控樣本和陽性樣本區分開，C試劑和F試劑檢測陰性質控樣本時熒光定量曲線出現翹尾，與低濃度樣本質控樣本的曲線較為接近，對于閾值設定較難，這對于后期結果的判斷有很大的影響。

本研究中7種核酸試劑質控品均含有陰性質控、陽性質控或臨界質控，但多數缺乏可以對核酸提取及擴增進行全程質控的內部參照物，因此無法確保所有的樣本均能夠進行有效的提取和擴增。此外還需要對其陰性質控品進行更深層的評估，多數試劑選用生理鹽水作為質控品，生理鹽水能夠保證樣本在核酸提取和擴增過程中不被污染，但是由于缺乏內部參照物，難以評估基質效應對臨床樣本的干擾，從而排除假陽性。

由于國外已有關于質粒缺失的新型變種沙眼衣原體的報道[13]，建議我國核酸檢測試劑中增加對新型變種沙眼衣原體的檢測。本次平行比較所涉及的檢測試劑均只能夠檢測沙眼衣原體，而核酸檢測大的趨勢是在同一個檢測中實現對多種病原體的檢測。

綜上所述，我國目前常用的國產沙眼衣原體核酸試劑的特異性較高，但是部分品牌試劑的敏感性有待進一步提高。部分品牌試劑的質控品應增加能夠全程控制的內部參照物。在試劑的應用范圍上也應擴展至對無創傷性樣本的檢測，從而更好地應用于無癥狀患者的篩查。此外，國外多數核酸試劑已經實現全自動化，減少了污染的概率，更利于在大型醫院及流行病學現場進行檢測。mRNA能夠更好地反映感染的狀態，對臨床隨訪，判斷預后有重要的意義，國內的試劑生產廠商可以在這方面作出努力。