微流控芯片與基因診斷關系的研究進展

張曉杰 費洪新

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

微流控芯片(MC)也稱為芯片實驗室，其已經廣泛于醫學、生物、電子、流體、化學等領域〔1,2〕，且MC可把樣品制備、反應、分離、檢測、擴增、分析等集成到一塊幾微米至幾百微米尺度的芯片上并自動完成所有基本過程。目前，MC已經廣泛地應用到醫學基因診斷(GD)方面，例如基因多態性檢測〔3〕、基因高效性測序〔4〕、基因快速性擴增〔5,6〕等，為此，本文主要對MC與GD關系進行綜述。

1 MC簡介

1.1MC相關概念 MC主要是指在幾微米至幾百微米的通道內將系統化、規范化、程序化的操作單元集成到一塊芯片上，且對微小體積的液體樣品進行系統化、規范化、處理或操作的一門系統科學和技術〔7〕。微陣列芯片主要是指將一個或者多個相同或者相似的系統化、規范化、程序化的操作單元或單元群平行地集成在同一芯片上的一門系統科學和技術〔8,9〕。生物芯片主要是指將已經知曉的生物信息包括DNA與RNA核酸序列固定于經過表面修飾的載體上，以此進行特異性地檢測未知DNA核酸序列、RNA核酸序列的一門系統科學和技術〔10,11〕。

1.2MC制備方法 實驗室制備MC需要采用電子計算機輔助軟件〔12，13〕設計出簡易型或者復雜型的MC圖紙，應用激光雕刻技術〔14,15〕在由聚二甲基硅氧烷、聚吡咯烷酮、線性聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、羥乙基纖維素、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酯等混合材料制備的雙面黏性薄膜〔16〕上切割出微米級、納米級的MC流體通道，將由聚二甲基硅氧烷制備的蓋片、雙面黏性薄膜、基片采用高溫加熱〔17,18〕的方式進行封接組裝，然后將制備好的MC與注射器、注射泵、熒光倒置顯微鏡、圖像記錄儀等連接起來，以此就建立起MC反應系統，隨后還需要進行MC表面修飾化、抗體固定化，其中前者多采用巰基-馬來酰亞胺基團〔19〕硅烷化耦聯法為MC表面修飾方法，而后者多采用鏈霉親和素-生物素〔20，21〕親合法進行抗體固定的優化，之后就可以進行MC的反應、分離、檢測、擴增、分析。

2 MC與GD的關系

2.1MC與基因多態性檢測的關系

2.1.1MC檢測基因缺失 一般而言，基因缺失主要是指高等動物、低等動物基因由于受到體內外各種因素的干擾促使機體部分基因區域缺如，由此將會影響高等動物、低等動物的部分結構和功能。目前，MC可以將高等動物、低等動物基因的大片段缺失區域進行確定，例如X 染色體連鎖的隱性遺傳病抗肌萎縮蛋白基因的缺失，使用MC可以進行檢測分析。國外一項研究顯示，通過直接監控微流體平臺單菌株生長，可以檢測大腸桿菌菌株中的基因組缺失效應，與野生型菌株相比，清潔基因組菌株的平均生長速度下降、平均滯后時間延長，且個體細胞生長速度和滯后時間之間直接相關，會表明清潔基因組種群更加不均勻，可見單菌株MC可以揭示細微的單個菌株反應〔22〕。另外，使用MC系統能夠將許多不同出芽酵母菌株高通量地開展研究，選擇野生型芽殖酵母和62個不同芽殖酵母大小對照相對基因缺失株進行掃描，將可以獲得不同基因缺失菌株的母細胞倍增時間、子細胞倍增時間、母細胞大小、子細胞大小等結果，可見MC可以對基因缺失進行基因診斷〔23,24〕。一項亞細胞水平研究報告顯示，線粒體是人體和動物細胞的能量產生和代謝中心，為維持生理功能提供大部分能量，其在細胞死亡過程中發揮重要作用，但是其缺失有效的修復系統，線粒體DNA受到的氧化損傷要高得多，而使用MC還可以應用于線粒體DNA缺失的診斷，與傳統的檢測方法相比，MC系統開發的樣品和試劑消耗較少，提取的線粒體DNA提取率較高，可以在150 min內自動化進行所有的檢測過程，可見MC將為分析線粒體DNA缺失提供了一個有力的工具〔25〕。近年來國外一項研究顯示，MC可以診斷非小細胞肺癌常規樣本表皮生長因子受體(EGFR)基因缺失且顯示非小細胞肺癌與EGFR外顯子19缺失明顯相關〔26〕。

2.1.2MC檢測基因重排 基因重排主要是指高等動物、低等動物基因從遠離啟動子的地方且轉移到距離啟動子比較近的地方，從而促使各類動物基因重新啟動轉錄的調控方式，其結合了傳統誘變技術、細胞融合技術、基因突變技術等。研究顯示，基因重排利于消化道淋巴瘤〔27〕和非小細胞肺癌〔28〕的診斷。國外研究顯示，通常高等動物、低等動物T、B 惡性淋巴瘤多表現T 細胞受體(TCR)基因、免疫球蛋白(Ig)H基因高度表達，通過以DNA交聯染料(YO-PRO)-1為熒光標記染料標記基因片段，經MC分析后可以明確單一IgH或TCR 基因重排方式，且明顯節省檢測時間，以此最終診斷出T、B 惡性淋巴瘤〔29,30〕。國外研究顯示，拷貝數變異(CNV)將會導致基因組變異且是引起基因組重排的一種現象，通過MC結合微流體毛細管電泳可以有效地檢測基因重排且此方法非常可靠〔31〕。

2.1.3MC檢測微小衛星DNA 微小衛星DNA主要是指廣泛存在于高等動物、低等動物基因組中長度100～500 bp多態性的DNA 序列且微小衛星DNA核心序列僅僅是2～5 bp，其也稱為短串聯重復(STR)〔32,33〕，使用MC檢測可以積極克服傳統的垂直板凝膠電泳背景模糊、費時費力、誤差較大等，但是也有相對不穩定〔34〕的部分缺點，MC檢測應用的范圍非常廣闊例如脆性X綜合征(FraX)精氨酸編碼的CGG STR序列、造血干細胞移植(HSCT)后可變數量串聯重復序列(VNTR)〔35〕、法醫鑒定所需的多重擴增STR基因座(DYS390、DYS393、DYS439)〔36,37〕等，這與通過STR來分析識別MC系統的快速化(3 h)〔38〕、模塊化、集成化(同時檢測17個STR)〔39〕的積極優勢有一定關系。國外法醫學資料研究顯示，MC可以通過檢測微小衛星DNA來進行法醫篩選和基因分型，尤其是可以快速對那些在爆炸或恐怖事件附近被拘留的嫌犯、企圖非法出入境的被拘留者、大規模災害的受害者等人群，可見微小衛星DNA快速篩查就顯得尤為重要，使用改進的Agilent 2100生物分析儀可以在80 s內檢測6個微小衛星DNA，且精確度為0.09～0.21 bp、分辨率值為2.5～4.1 bp，可見MC檢測微小衛星DNA具有快速化、準確化、高效化等基本特點〔40〕。

2.1.4MC檢測基因突變 基因突變主要是指高等動物、低等動物受到各種因素的作用下，基因出現改變，包括單個堿基、多個堿基的改變，使用MC可以檢測基因突變，例如秀麗隱桿線蟲cwn-1突變〔41〕、循環系統腫瘤細胞基因突變〔42〕。一般而言，所有疾病相關基因逐漸被克隆基因突變包括單鏈構象多態性、限制性片段長度多態性所取代，其中，單鏈構象多態性〔43,44〕主要是指等長DNA單鏈出現單個堿基差異，隨后由于鏈內彼此作用而形成構象差異，使用熒光染料標記引物，使用MC分析乳腺癌易感基因，可以在2 min內就可以對乳腺癌易感基因的單鏈構象多態性檢測，這比毛細管電泳所需的時間要明顯縮短；限制性片段長度多態性〔45,46〕是指某些特殊的點突變會促使某些特異性的限制性內切酶位點缺失，使用MC可以檢測分析限制性片段長度多態性。國外研究資料顯示，非小細胞肺癌樣品進行表皮生長因子受體(EGFR)基因突變的驗證研究測試可以使用MC來進行，通過一種快速而靈敏MC技術可以將EGFR快速檢測出來且成本低廉〔47〕。

2.2MC與基因高效性測序的關系 基因測序主要是指采用先進的方法對高等動物、低等動物核酸序列進行系統化、規范化、快速化分析〔48,49〕，此過程需要的工程量尤為巨大。目前，對MC實驗室主要采用96根陣列毛細管電泳對基因序列進行系統化測定，雖在一定程度上加快了人類基因組項目，但是還不能實現高效、靈敏、快速、價廉、自動、準確等基本特點，而MC可以實現高效基因測序，例如腸道微生物基因測序〔50〕、酵母基因測序〔51〕、肺癌腫瘤細胞基因測序〔52〕等檢測效率非常高。

2.3MC與基因快速性擴增的關系 基因快速性擴增通常是指采用聚合酶鏈反應(PCR)將目標靶點DNA片段呈倍數量增加并通過電泳方式將目標靶點DNA片段識別、分離、分析等〔53，54〕，此過程有需要較多的試劑、加熱時間長、冷卻時間長等缺點。目前，在實驗室內基因快速性擴增可采用MC，通過將MC與PCR結合，以此建立起微型化的MC-PCR反應體系，將會明顯克服PCR的缺點包括PCR需要較多的試劑、加熱時間長、冷卻時間長等，同時MC-PCR反應體系擴增產物很容易與樣品分離且可實現檢測的自動化、集成化、微型化。目前，MC-PCR反應體系可以檢測土壤細菌基因〔55〕、腫瘤細胞基因〔56〕、血液細菌基因〔57〕等，足見其應用十分廣闊。

綜上，MC可以應用到醫學GD方面，例如基因多態性檢測、基因高效性測序、基因快速性擴增等，可見MC與GD均是密切相關的，推測使用MC將是今后GD檢測分析的新方法之一。