防己中不同活性成分綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

俞媚華, 熊 娟, 達(dá)慎思

(復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院, 上海 201203)

防己是防己科千金藤屬植物粉防己StephaniatetrandraS. Moore的干燥根,早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中對(duì)其就有記載“防己如險(xiǎn)健之人,幸災(zāi)樂(lè)禍,能首為亂階,若善用之,亦可御敵。其名或取此義。解離,因其紋解也”[1]。民間傳統(tǒng)將其用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛,濕熱肢體疼痛，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究又發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)痛、消炎、抗過(guò)敏、降血壓和保護(hù)心肌等作用[2]。防己中含有大量的生物堿,其中大部分是雙芐基異喹啉生物堿,漢防己甲素和乙素含量較高,活性也最佳[3]。

“漢防己生物堿的提制和鑒定”一直是復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院“實(shí)驗(yàn)藥物化學(xué)I”一個(gè)較為經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)[4],要求學(xué)生掌握總生物堿中酚性叔胺堿和非酚性叔胺堿分離與純化的方法,了解生物堿類化學(xué)成分的沉淀反應(yīng),是一個(gè)專業(yè)性較強(qiáng)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。但該實(shí)驗(yàn)存在一些問(wèn)題：屬驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),學(xué)生只需按部就班地完成實(shí)驗(yàn),記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,專業(yè)綜合知識(shí)得不到體現(xiàn)；實(shí)驗(yàn)前學(xué)生僅從課本中了解防己藥材中含生物堿類成分,沒(méi)有實(shí)驗(yàn)的感性認(rèn)識(shí)；防己藥材利用萃取、重結(jié)晶的方法進(jìn)行提取和粗分離,只能得到漢防己甲素和乙素的混合物,不能完全分開；沒(méi)有化合物的純化和純度測(cè)定步驟,學(xué)生對(duì)化合物純度沒(méi)有概念；幾乎沒(méi)有使用任何精密的大型儀器。顯然這樣的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)不能滿足現(xiàn)行天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)要求,因此將這個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為綜合性實(shí)驗(yàn),使學(xué)生將所學(xué)的天然藥物化學(xué)、藥物分析學(xué)、現(xiàn)代色譜技術(shù)、波譜解析等多門課程的知識(shí)在實(shí)驗(yàn)中綜合應(yīng)用,提高了學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能。

1 防己中不同活性成分綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)介

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

(1) 掌握脂溶性酚性生物堿與非酚性生物堿的提取分離方法；

(2) 了解正交試驗(yàn)優(yōu)選防己中漢防己甲素和乙素的提取工藝；

(3) 學(xué)習(xí)柱色譜分離漢防己甲素和乙素；

(4) 熟悉生物堿的一般理化性質(zhì)及各種檢識(shí)方法。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理和主要內(nèi)容

本實(shí)驗(yàn)利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選防己中漢防己甲素和乙素的最佳提取工藝,強(qiáng)化天然藥物化學(xué)中提取這一關(guān)鍵步驟；防己中叔胺型生物堿的親脂性,采用有機(jī)溶劑萃取分離脂溶性生物堿和親水性生物堿；利用漢防己甲素和乙素結(jié)構(gòu)上的差別——7位取代基的差異,采用柱色譜分離二者[5-6]；利用高效液相色譜儀(HPLC)評(píng)價(jià)防己正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及最后分離得到的單體化合物,采用質(zhì)譜(MS)、核磁共振儀(NMR)、紅外(IR)、紫外(UV)等波譜手段解析結(jié)構(gòu)。

2 防己中不同活性成分綜合性實(shí)驗(yàn)方案

2.1 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選防己中漢防己甲素和乙素的提取工藝

2. 1.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

取藥材量100 g,選用L9(34)正交表,以浸膏得率、漢防己甲素含量、漢防己乙素含量為綜合考查指標(biāo),進(jìn)行了9次實(shí)驗(yàn),分別考查提取次數(shù)、提取時(shí)間、溶劑用量和乙醇濃度。其中各因素水平具體見(jiàn)表1[7]。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表

2.1.2 綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇

防己生物堿是防己的主要活性成分,其中漢防己甲素和乙素占了總藥材的1%左右；故選用這2個(gè)成分的含量與浸膏得率(權(quán)重比5∶5) 進(jìn)行綜合評(píng)分,以綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行提取工藝最佳參數(shù)的優(yōu)選。綜合評(píng)分計(jì)算分值方法如下：綜合評(píng)分=(漢防己甲素、乙素含量總和) / Max(漢防己甲素、乙素含量總和)×0.5+浸膏得率×0.5/Max(浸膏得率)。

2.1.3 檢測(cè)方法

(1) 漢防己甲素和乙素測(cè)定方法。色譜柱C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%三乙胺溶液(70∶30)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL[8]。

(2) 對(duì)照品溶液制備和線性關(guān)系考查。精密稱取漢防己甲素對(duì)照品、漢防己乙素對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 mL含漢防己甲素50 μg、漢防己乙素25 μg 的混合溶液[9]。取對(duì)照品混合溶液5、10、15、20、25、30 μL,分別注入色譜儀,以峰面積的積分值為縱坐標(biāo),以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量(μg) 為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間有限，此兩部分會(huì)在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)完成。學(xué)生實(shí)驗(yàn)以講解HPLC的操作使用為重點(diǎn)。

(3) 供試品溶液制備。精密量取防己提取液50 mL,水浴旋蒸至近干,加1%鹽酸15 mL,濾去不溶物,加濃氨水4 mL,加氯仿50 mL萃取3次,合并提取液,蒸干氯仿層,殘?jiān)蛹状既芙?并轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻即得。

2.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用SPSS19.0 軟件[10]對(duì)漢防己甲素和漢防己乙素和浸膏得率的綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果、極差、方差分析結(jié)果見(jiàn)表2、表3、表4。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表3 極差分析

表4 醇提工藝方差分析

根據(jù)極差分析和方差分析結(jié)果可見(jiàn),各因素的影響大小順序?yàn)? B > D > C > A,最佳提取工藝條件為B3D3C3A1,其中因素B 即提取次數(shù)有極顯著性影響; 其他各因素均未有顯著性影響,考慮到60%的乙醇實(shí)驗(yàn)室減壓濃縮耗時(shí)較長(zhǎng),故選擇D1C3A1。即防己的提取工藝條件為：以6 倍量95%乙醇提取3 次,每次1 h。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,根據(jù)每年實(shí)驗(yàn)藥材批次不同可能會(huì)有所不同。每組學(xué)生自由選取1個(gè)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)合各組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果學(xué)習(xí)如何使用正交實(shí)驗(yàn)的方法優(yōu)化提取工藝。但由于每組學(xué)生操作習(xí)慣不同,極差和方差可能會(huì)偏大。

2.2 防己中活性成分的分離

2.2.1 萃取法提取非酚性親脂性叔胺生物堿

選取正交實(shí)驗(yàn)方案得到的防己乙醇提取液,減壓濃縮近干,加入1% HCl,充分?jǐn)嚢?直至加酸水時(shí)溶液不發(fā)生渾濁為止,過(guò)濾棄去沉淀。濾液滴加濃氨水中和至pH 9左右,此時(shí)親脂性的叔胺堿游離析出,用氯仿500 mL分3次萃取水層,合并得氯仿溶液。以1%氫氧化鈉溶液200 mL分3次萃取,再以水20 mL/次洗滌2次。得氯仿層,減壓濃縮得粗制非酚性親脂性叔胺生物堿[11]。

2.2.2 重結(jié)晶純化叔胺生物堿

將非酚性生物堿用加丙酮熱溶解,重結(jié)晶,待結(jié)晶析出后,將母液與晶體分離。母液再濃縮重復(fù)處理,尚可得結(jié)晶。合并多次結(jié)晶,為漢防己甲素和乙素的混合物[12]。

2.2.3 柱色譜分離漢防己甲素和乙素

(1) 裝柱：稱取20 g硅膠(200～300目)加入50 mL二氯甲烷拌成勻漿,打開柱下活塞,將勻漿一次傾入層析柱內(nèi),等待柱子壓實(shí)；

(2) 上樣：取漢防己甲素和乙素的混合物100 mg加入二氯甲烷1 mL溶解后,用滴管將溶液沿著層析柱內(nèi)壁均勻加入。

(3) 洗脫: 二氯甲烷∶甲醇=20∶1為洗脫劑,進(jìn)行洗脫,收集流份3 mL左右/份

(4) 薄層色譜檢識(shí)：以二氯甲烷∶甲醇=10∶1為展開劑,以對(duì)照品作對(duì)照,相同斑點(diǎn)的組分合并,稱重。

2.3 HPLC(面積歸一化法)測(cè)定純度

使用正交實(shí)驗(yàn)的色譜條件,測(cè)定漢防己甲素和乙素的純度,結(jié)果表明漢防己甲素純度為98.93%、漢防己乙素純度為98.85%。

2.4 漢防己甲素和乙素的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色針狀結(jié)晶(丙酮中結(jié)出),熔點(diǎn)150～152 ℃/217～218 ℃。UV(MeOH) 譜圖中在230、280 nm處有吸收峰,說(shuō)明化合物1中有苯環(huán)結(jié)構(gòu)。IR譜圖中在1 605、1 462 cm-1處的吸收峰也證明化合物1中有苯環(huán)存在。EI-MS圖譜中給出[M + H]+.峰為623,高分辨質(zhì)譜給出分子式：[C38H43N2O6]+.,計(jì)算不飽和度為18,說(shuō)明化合物1有可能是雙芐基異喹啉生物堿。結(jié)合化合物1的1H-NMR(400 MHz, CDCl3)數(shù)據(jù)δ ppm: 3.72(1H, d,J= 9.6 Hz, H-1), 2.36(3H, s, NCH3), 2.91(1H, m, Ha-3), 3.48(1H, m, Hb-3), 2.39(1H, m, Ha-4), 2.89(1H, m, Hb-4), 6.29(1H, s, H-5), 3.75(3H, s, 6-OCH3), 3.18(3H, s, 7-OCH3), 2.48(1H, dd,J= 14.4, 1.8 Hz, Ha-α), 2.67(1H, dd,J= 14.4, 10.2 Hz, Hb-α), 6.52(1H, d,J= 2.2 Hz, H-10), 3.91(3H, s, 1-OCH3), 6.81(1H, d,J= 8.4 Hz, H-13), 6.86(1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-14), 3.84(1H, d,J= 11.4, 6.0 Hz, H-1′), 2.64(3H, s, N′-CH3), 2.83(1H, m, Ha-3′), 3.39(1H, m, Hb-3′), 2.69(1H, m, Ha-4′), 2.91(1H, m, Hb-4′), 6.52(1H, s, H-5′), 3.38(3H, s, 6′-OCH3), 6.00(1H, s, H-8′), 2.77(1H, dd,J= 11.4, 12.6 Hz, Ha-α), 3.22(1H, dd,J= 12.6, 6.0 Hz, Hb-α′), 6.27(1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-10′), 6.77(1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-11′), 7.13(1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-13′), 7.34(1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-14′)。與文獻(xiàn)對(duì)照[13],證明化合物1為漢防己甲素。

化合物2為白色粒狀結(jié)晶(丙酮中結(jié)出),熔點(diǎn)177～179 ℃/237～238 ℃。UV和IR譜圖與化合物1相似。EI-MS圖譜中給出[M + H]+.峰為609,高分辨質(zhì)譜給出分子式：[C37H41N2O6]+.,計(jì)算不飽和度為18,說(shuō)明化合物2也可能是雙芐基異喹啉生物堿。結(jié)合1H- NMR(400 MHz, CDCl3) δ ppm: 2.37(3H, s, 2-NCH3), 2.39～2.45(1H, m), 2.53～2.57(1H, m), 2.68(3H, s, 2′-NCH3), 2.70～3.03(7H, m), 3.23～3.31(1H, m), 3.39(3H, s, 6′-OCH3), 3.41～3.65(2H, m), 3.74～3.78(1H, m, H-1), 3.78(3H, s, 6-OCH3), 3.88～3.94(1H, m, H-1′), 3.93(3H, s, 12-OCH3), 6.05(1H, s, H-8′), 6.31(1H, s, H-5), 6.34(1H, dd,J=8.4, 2.4 Hz, H-10′), 6.55(1H, s, H-5′), 6.57(1H, s, H-10), 6.82(1H, dd,J=8.4, 2.4 Hz, H-11′), 6.86(2H, br s, H-13, H-14), 7.13(1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-13′), 7.36(1H, dd,J=8.4, 2.4 Hz, H-14′)。與文獻(xiàn)對(duì)照[14],證明化合物2為漢防己乙素。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),將“漢防己生物堿的提制和鑒定”設(shè)計(jì)成為綜合性實(shí)驗(yàn),增加了正交法優(yōu)化提取工藝的步驟,使原本簡(jiǎn)單枯燥的提取步驟也變得有意義起來(lái)。在正交實(shí)驗(yàn)里,學(xué)生不僅可以學(xué)習(xí)如何從植物中提取有效成分,更可以學(xué)會(huì)如何使工藝最優(yōu)化；用多種提取分離方法提取分離純化生物堿類化合物,通過(guò)酸提堿沉、有機(jī)溶劑萃取、重結(jié)晶和柱色譜法聯(lián)合使用,使學(xué)生熟悉天然藥物化學(xué)中最常用的幾種分離純化化合物的操作方法；增加純度測(cè)定和結(jié)構(gòu)解析的方法,使學(xué)生掌握HPLC、紅外和紫外分光光度計(jì)的簡(jiǎn)單使用。通過(guò)質(zhì)譜、核磁共振等波譜技術(shù)分析單體化合物結(jié)構(gòu),使學(xué)生對(duì)結(jié)構(gòu)解析的過(guò)程有一定的感性認(rèn)識(shí)。

綜上所述,以防己作為一個(gè)典型案例,使學(xué)生對(duì)植物藥的研究有一個(gè)較為全面的了解, 其中包括天然藥物化學(xué)、藥物化學(xué)、藥物分析等多學(xué)科內(nèi)容。這樣的實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式的設(shè)計(jì)[15]不僅可以培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手實(shí)踐能力、綜合知識(shí)運(yùn)用能力,更能使學(xué)生盡早地接觸科研,參與科研,大大縮短學(xué)習(xí)的適應(yīng)期,培養(yǎng)出“知識(shí)、能力、素質(zhì)”綜合發(fā)展的創(chuàng)新型人才。