牦牛腹瀉糞樣的細菌分離鑒定與耐藥性檢測

李佛生, 胡舒昶, 謝 鑫, 李一璠, 汪 杭, 馮 蘭, 楊 鑫

(四川大學 生命科學學院 生物科學國家級實驗教學示范中心, 四川 成都 610065)

紅原地區的牦牛是四川省阿壩藏族羌族自治州紅原地區的標志性物種,其對高原地區高寒 、低氧等惡劣自然條件具有良好的適應能力,其養殖完全依賴紅原天然草場,其乳、肉營養價值極高,在高原地區具有不可替代的生態與經濟地位[1]。腹瀉問題是牦牛犢不能正常發育甚至死亡的重要原因。牦牛腹瀉的感染性因素主要有細菌感染、病毒感染、寄生蟲感染和缺乏微量元素。目前對于常見畜牧產品腹瀉問題的研究基本都涉及細菌感染因素,如郭建超[2]、夏晨陽[3]等探討了豬、羊腹瀉的細菌感染因素,但有關牦牛腹瀉疾病的研究多見病毒感染因素,少見對細菌感染因素研究。本實驗有助于補充牦牛腹瀉在細菌感染方面的研究。

本檢測從紅原地區腹瀉犢牛采集腹瀉糞樣,分離、鑒定細菌,采用藥敏紙片法進行藥敏試驗,得到細菌耐藥譜,從而為紅原地區牦牛腹瀉問題的抗生素解決方案提供了建議和參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本次試驗所用菌株均由小組成員于2017年在四川省阿壩藏族羌族自治州中部紅原縣紅原地區16頭牦牛犢腹瀉糞樣中分離得到,本次腹瀉樣本共計16份,其中1份為血樣糞便。

1.2 培養基與試劑

1.2.1 微生物培養基

PBS磷酸緩沖鹽溶液、伊紅美蘭瓊脂培養基(EMB)、甘露醇高鹽瓊脂培養基(MSA)、三糖鐵培養基(CN)、麥康凱培養基(MC)，瓊脂購自國產生物試劑公司。

1.2.2 實驗試劑

PrimerSTAR Max DNA Polymerase、DNA Maker和PCR產物回收試劑盒購自大連寶生物公司，引物合成自成都擎科梓熙生物技術有限公司。

1.2.3 藥敏紙片

9種抗生素藥敏紙片(紅霉素(E)、慶大霉素(CN)、四環素(TE)、萬古霉素(VA)、環丙沙星(CIP)、復方新諾明(SXT)、氯霉素(C)、氨曲南(ATM)、氟苯尼考(FFC))購自英國Thermofisher SCIENTIFIC生物科技公司。

1.2.4 儀器設備

PCR儀(Bio-rad T100)、生化培養箱LRH-250A型、離心機(eppendorf 5424)、生物安全柜BHC-1300A2型、全自動立式高壓滅菌器(ZEALWAY GR85DA)、冰箱BCD-301型、搖床。

1.3 菌株的分離、純化與鑒定

1.3.1 菌株的分離純化

采樣后將糞樣暫時置于冰盒中保存,并立即帶回實驗室,按照糞樣與PBS磷酸緩沖鹽溶液比例為1∶4處理糞樣,混勻后放入離心機以10 000 r/min轉速離心30 min,并取上清液備用；配置BHI液體培養基,在10 mL的EP管中加入5 mL BHI液體培養基和1 mL糞樣上清液,放入搖床中在37 ℃下搖晃過夜；之后采用平板劃線法將細菌分別接種至伊紅美藍瓊脂培養基(EMB)、甘露醇高鹽瓊脂培養基(MSA)、三糖鐵培養基(CN)、麥康凱(MC)培養基上,在37 ℃恒溫箱中過夜培養；取出過夜培養的培養皿,挑取培養基上的單菌落，并接種至裝有5 mL BHI培養基的10 mL EP管中,在37 ℃的搖床中振蕩過夜；取出EP管得分離純化的菌株。

1.3.2 菌落的形態學鑒定

通過長出菌落的形態,包括大小、形狀、邊緣、光澤、質地、顏色和透明程度等進行粗略鑒定[4]。

1.3.3 16S rRNA基因序列分析

將分離純化好的菌株37 ℃培養過夜后,分別挑取菌落,采用16S rRNA細菌鑒定的通用引物1492R: 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′,27F: 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,進行PCR擴增,得到目的片段約為1500 bp。PCR 擴增體系(25 μL)： PrimerSTAR Max DNA Polymerase 12.5 μL,引物F/R各1.0 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR反應：95 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸5 s,35 個循環；72 ℃再延伸5 min。擴增產物經1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送至成都擎科梓熙生物技術有限公司測序[5-7]。

1.4 藥敏試驗

1.4.1 菌株復蘇

從-20 ℃冰箱中取出冷凍保存的菌株,在常溫下靜置;配置LB液體培養基,加入到10 mL 滅菌后的EP管中,每支EP管中加入5～6 mL配置好的LB液體培養基;再加入復蘇后的菌液20 μL；將EP管捆綁好放入搖床中,在37 ℃下以180 r/min的轉速振蕩過夜。

1.4.2 耐藥性檢測

采用藥敏紙片法測定64株菌株對9種抗生素的耐藥情況[8-11]。在培養皿內放置完藥敏紙片后將培養皿倒置,放入37 ℃恒溫箱中培養24 h后,通過測量抑菌圈直徑對菌株的耐藥性進行記錄和比較,并根據CLSI M100-S20標準[12],得到不同菌株對不同抗生素的耐藥情況。

2 結果與分析

2.1 紅原地區牦牛腹瀉樣品細菌的分離、鑒定結果

用EMB培養基篩選19株菌株,用MSA培養基篩選出16株菌株,用CN培養基篩選出9株菌株,用麥康凱培養基篩選出20株菌株。對所得菌株進行16S rRNA基因序列分析,最終篩選鑒別出64株菌株,其中包含沙門氏菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、成團泛菌和阪崎腸桿菌(見表1)。

表1 紅原地區牦牛腹瀉樣品細菌的分離、鑒定結果

表1(續)

注：編號中的數字代表糞樣編號；編號中的第1個和第2個英文字母代表篩選出菌種所用的培養基英文縮寫,EMB培養基縮寫為E,MSA培養基縮寫為MS、CN培養基記為CN、麥康凱培養基記為MC；編號中的第3個字母表示挑取菌落的顏色,R表示紅色,W表示白色,B表示黑色,Y表示黃色。

2.2 耐藥結果

2.2.1 細菌耐藥率

根據藥敏試驗結果(見圖1和圖 2)統計,得細菌耐藥率見表2—表5。表中耐藥率和敏感率數值后括號內/后的數字為樣品數，/前的數字為耐藥樣品或敏感樣品數。

圖1 大腸桿菌(9EB)的藥敏試驗結果

圖2 沙門氏菌(9MS)的藥敏試驗結果

具體情況如下：大腸桿菌對各藥物耐藥率R有：R(VA)(93.33%)>R(E)(86.67%)>R(C)(53.33%)>R(TE)(20.00%)>R(SXT/FFC)(13.33 %)，但對CN、CIP、ATM耐藥率為0,對CN、CIP、ATM的敏感率為100%。

沙門氏菌對各藥物的耐藥率有：R(E/VA)(100.00%)>R(C)(91.89%)>R(FFC)(8.11%)>R(SXT)(2.70%)，但對CN、TE、ATM耐藥率為0，對各種藥物的敏感率S有：S(CN/CIP/ATM)(100.00%)>S(SXT)(94.59%)>S(TE)(62.16%)>S(FFC)(40.54%)>S(C)(5.41%)。

坂崎腸桿菌對各藥物耐藥率有：R(E)(100.00%) >R(VA)(75.00%)>R(TE/C)(50.00%)>R(CIP/SXT)(25.00 %)，但對CN、ATM、FFC的耐藥率為0,對CN、ATM的敏感率為100.00%。

糞腸球菌對E/VA/C藥物的耐藥性為100.00%；CN/CIP/SXT/ATM敏感率為100.00 %，對FFC為50.00%。成團泛菌、芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌對E/VA均耐藥,并且成團泛菌、芽孢桿菌對C也耐藥；成團泛菌、芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌對CN、CIP、SXT、ATM都敏感,此外,成團泛菌和枯草芽孢桿菌還對FFC敏感,芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌還對TE敏感。

表2 大腸桿菌菌株對抗生素的耐藥情況

表3 坂崎腸桿菌菌株對抗生素的耐藥情況

表4 糞腸球菌菌株對抗生素的耐藥情況

表5 沙門氏菌菌株對抗生素的耐藥情況

2.2.2 多重耐藥譜

由圖3可知,紅原地區牦牛腹瀉樣細菌對E、VA和C耐藥,對FFC和TE的耐藥性差異很大,但對CN、CIP、ATM和SXT敏感。然而,值得注意的是,紅原地區牦牛腹瀉樣中大腸桿菌和沙門氏菌均產生1種以上抗生素的多重耐藥性,且大多數存在3種以上抗生素的多重耐藥情況,分別占53.33 %和91.89 %(見表6)。

圖3 菌株對不同抗生素的柱形耐藥譜

抗生素種數大腸桿菌耐藥菌株數占菌株數百分比/%沙門氏菌耐藥菌株數占菌株數百分比/%0種00001種213.33002種533.3338.113種及以上853.333491.89

3 討論

本次測檢從紅原地區牦牛腹瀉糞樣中分離了得到了7種共64株菌株,其中主要包括了大腸桿菌(23.44 %)和沙門氏菌(57.81 %)。而周雪雁等人從健康牦牛糞樣中分離得到糞腸球菌[13],劉明春等人從犢牛腹瀉糞樣中分離得到大腸桿菌[14]。相較于之前的研究,本實驗從罹患腹瀉牦牛的腹瀉糞樣中分離得到更加全面的致病菌種,具有較大的參考價值。

本次檢測使用了藥敏紙片法，檢測了64株紅原地區牦牛腹瀉糞樣細菌菌株對9種抗生素的耐藥性,完善了紅原地區牦牛腹瀉致病菌的耐藥譜。通過耐藥率和多重耐藥情況可以看出,試驗菌種的耐藥譜范圍有限,普遍對特殊的幾種抗生素(E和VA)產生極強的耐藥性,卻對其他數種抗生素(CN、CIP、SXT、ATM)表現出高度敏感。相比之下,喻華英等人的研究缺少了四環素、萬古霉素、氨曲南、氯霉素、氟苯尼考的藥敏試驗,但增加了頭孢唑啉、阿莫西林、諾氟沙星、痢特靈的藥敏試驗[15-16]；劉明春等人的研究缺少了氨曲南、氯霉素、氟苯尼考的藥敏試驗,但增加了妥布霉素、丁胺卡那、頭孢他啶、頭孢哌酮、利福平、氟哌酸、呋喃妥因、卡那霉素、氨芐西林的藥敏試驗[13],可與本次試驗互為補充。與喻華英等人的藥敏試驗結果相比,本試驗中大腸桿菌對CIP、CN極為敏感,對E高度耐藥,與其試驗結果基本一致,但敏感和耐藥程度都相對更高；沙門氏菌對CIP、CN、SXT都極為敏感,敏感程度相對更高,而對E具有極強的耐藥性,這與喻華英等人的試驗結果不相一致。

本試驗結果中,大多數菌種對不同抗生素的耐藥性幾乎呈現出較為極端的情況(耐藥或敏感程度接近100 %),并且不同菌種的耐藥情況有很大重疊。這可能與紅原當地長期使用少數幾種抗生素防治牦牛腹瀉疾病,從而導致致病菌對這幾種抗生素(E、VA、C)產生了較為單一并且極強的耐藥性,而對其他抗生素高度敏感有關。此外,紅原地區地處高原、較為封閉的特殊地理環境,也可能是紅原地區牦牛腹瀉糞樣中細菌具有如此獨特的耐藥情況的重要原因。

根據本次試驗結果可以推測,對于紅原地區牦牛腹瀉疾病,使用多樣化的抗生素,能夠有效控制紅原地區牦牛的腹瀉病情。雖然對于引起紅原地區牦牛腹瀉的致病菌,僅僅依靠試驗所使用的抗生素中的一種或兩種,就能有效抑制致病菌的增殖,但是由于抗生素的單一使用,極易使致病菌產生在短時間內產生新的耐藥性,并不適用于長期控制紅原地區牦牛的腹瀉疾病。就抗生素防治而言,嘗試尋找新的抗生素,減少同種抗生素的重復使用,同時利用現有抗生素和新抗生素進行防治,是較為合理解決方案。除此之外,嘗試運用生態學方法防治紅原地區牦牛腹瀉的發生可能是更加有利于生態保護、更加持久的解決方案。