微波輔助法提取紫甘薯花青素及其抗氧化性研究

蔡圓圓，葉杭鈺，姜海峰，樓夢(mèng)醫(yī)，蔣穎整，柯薇

（浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310015）

紫甘薯花青素是從紫甘薯塊莖和莖葉中浸提出來(lái)的一種天然色素，色澤鮮亮自然，無(wú)毒，無(wú)特殊氣味[1-2]，且在抗突變、抗腫瘤、改善視力、預(yù)防和治療心血管疾病、保護(hù)肝臟等[3-4]方面具有良好的作用，是一種理想的天然色素資源。但是，花青素的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，而其結(jié)構(gòu)又直接影響著花青素的穩(wěn)定性、抗氧化活性。因而研究花青素的抗氧化活性對(duì)促進(jìn)花青素在食品加工及醫(yī)藥等方面的應(yīng)用，正確評(píng)價(jià)富含花青素食品的功能性，開發(fā)花青素功能食品起著至關(guān)重要的作用。

本文采用微波輔助法提取紫甘薯中的花青素，采用Fenton法、鄰苯三酚氧化法和DPPH法研究其抗氧化活性，為紫甘薯花青素的開發(fā)與應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：紫甘薯，購(gòu)自超市。試劑：乙醇、鹽酸均為分析純，DPPH、維生素C、維生素E、Trip-HCl。

儀器：FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)；VIS-7220紫外可見分光光度計(jì)； CS101-3EB電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司恒大儀器廠）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；TD4Z低速離心機(jī)（湖南省凱達(dá)實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；格蘭仕WD800微波爐。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 前期處理

將購(gòu)買的紫甘薯，洗凈，切片，烘干，磨粉，過(guò)80目篩后，得到紫甘薯粉末，保存于保鮮袋中，放置在陰涼處備用。

1.2.2 微波輔助法提取紫甘薯花青素

稱取紫甘薯粉樣品20 g，平鋪于小燒杯中，以乙醇為汽化劑，微波輻射一定時(shí)間使之汽化，在60 ℃水浴下用0.2% HCl+65%乙醇提取60 min，得到紫甘薯花青素提取液。分別考察汽化劑濃度、紫甘薯粉與汽化劑比例、微波功率、微波時(shí)間對(duì)花青素提取的影響。

1.2.3 抗氧化性測(cè)定

1.2.3.1 清除·OH能力的測(cè)定[5]

采用Fenton反應(yīng)法生產(chǎn)·OH，以·OH氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有強(qiáng)吸收峰。體系中加入清除·OH的物質(zhì)，會(huì)減少有色物質(zhì)的生成，降低吸光度。具體步驟：取若干支25 mL的比色管，加入9 mmol/L FeSO41 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，不同濃度花青素2 mL，最后加8.8 mmol/L H2O22mL啟動(dòng)反應(yīng)，于室溫下反應(yīng)1 h。以蒸餾水調(diào)零，在510 nm處測(cè)定樣品的吸光度A，計(jì)算清除率。

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；A為樣品組的吸光度；A1為樣品溶液本身的吸光度。

1.2.3.2 清除O2-能力的測(cè)定[6]

采用鄰苯三酚氧化法：在10 mL試管中加入3 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），1 mL不同濃度的樣品，25 ℃水浴平衡20 min后，加入0.3 mL 7.0 mmol/L的鄰苯三酚反應(yīng)4 min，加入1 mL 10.0 mol/L HCl終止反應(yīng)，在420 nm處測(cè)定其吸光度A，計(jì)算清除率。

式中，A0為空白對(duì)照液的吸光度；A為樣品組的吸光度；A1為樣品溶液本身的吸光度。

1.2.3.3 清除DPPH能力的測(cè)定[7]

吸取樣品溶液2 mL，與2×10-4mol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液混合，搖勻，放置30 min。以2 mL蒸餾水與2 mL無(wú)水乙醇的混合溶液為對(duì)照，測(cè)定上述溶液在517 nm處的吸光度值A(chǔ)1。吸取樣品溶液2 mL，與2 mL蒸餾水混合，以蒸餾水為對(duì)照，測(cè)定吸光值A(chǔ)2。吸取2×10-4mol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液2 mL與蒸餾水混合，以2 mL蒸餾水與2 mL無(wú)水乙醇的混合溶液為對(duì)照，測(cè)定吸光值A(chǔ)0，計(jì)算清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助法提取

2.1.1 汽化劑濃度對(duì)提取率的影響

汽化劑濃度對(duì)提取率的影響見圖1。由圖1可知，在60%～75%范圍內(nèi)，隨著汽化劑濃度的升高，提取率增加，而在75%～90%范圍內(nèi)，提取率下降，在75%乙醇為汽化劑時(shí)，提取率為71.5%。乙醇作為有機(jī)溶劑可以破壞蛋白，增加膜的通透性，有助于花青素的溶出。乙醇濃度的增加，有利于花青素的提取，但過(guò)高的濃度，會(huì)破壞其中的花色苷鍵。故采用75%乙醇為最佳汽化劑濃度。

圖1 汽化劑濃度對(duì)提取率的影響

2.1.2 紫甘薯粉與汽化劑比對(duì)提取率的影響

紫甘薯粉與汽化劑比對(duì)提取率的影響見圖2。由圖2可知，隨著紫甘薯粉與汽化劑比的升高，提取率先升后降，并在1:1.6（g：mL）時(shí)，提取率最高，為81.1%。紫甘薯粉與汽化劑體積比的增加使汽化劑與紫甘薯粉的接觸面積增加，有利于汽化劑的破壁作用，而過(guò)高的比例，使得紫甘薯粉完全溶于汽化劑中，導(dǎo)致細(xì)胞成分被破壞，帶來(lái)過(guò)多的溶出物。故確定紫甘薯粉與汽化劑比為1:1.6。

2.1.3 微波功率對(duì)提取率的影響

微波功率對(duì)提取率的影響見圖3。由圖3可知，隨著微波功率的增強(qiáng)，提取率先升后降，并在中低火功率下最高，為84.7%。由于微波的快速加熱，使得細(xì)胞破壁效果提升，花青素提取率升高。低功率情況下，細(xì)胞破壁未完全使得花青素?zé)o法完全被提取出，但花色苷鍵的熱穩(wěn)定性不高，功率增加，過(guò)高的溫度使其斷裂破壞花青素，使得花青素提取率降低。故確定中低火288 W為最佳微波功率。

圖2 紫甘薯粉與汽化劑比對(duì)提取率的影響

圖3 微波功率對(duì)提取率的影響

2.1.4 微波時(shí)間對(duì)提取率的影響

微波時(shí)間對(duì)提取率的影響見圖4。由圖4可知，隨著微波時(shí)間的增加，花青素提取率先升后降，在15 s時(shí)提取率最高，為86.5%。微波輻射時(shí)間越長(zhǎng)，萃取出的天然花青素越多，但連續(xù)微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)對(duì)花青素造成破壞，不利于提高得率。故采用微波最佳輻射時(shí)間為15 s。

圖4 微波時(shí)間對(duì)提取率的影響

在汽化劑為75%乙醇，紫甘薯與汽化劑比1:1.6（g：mL），微波功率288 W，微波時(shí)間15 s的條件下，進(jìn)行多次提取實(shí)驗(yàn)，得提取率為86.7%。

2.2 抗氧化性測(cè)定

2.2.1 清除·OH能力

·OH是生物活體內(nèi)最活潑，最具進(jìn)攻性的活性氧，能導(dǎo)致生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)糖類、氨 基酸及核酸等物質(zhì)的氧化性損傷，是細(xì)胞壞死或突變的誘因之一，因此測(cè)定紫甘薯花青素清除·OH的能力對(duì)研究其抗氧化活性具有一定的意義。不同濃度的花青素對(duì)·OH清除率影響見圖5。由圖5可知，紫甘薯花青素清除·OH的能力隨著濃度的增加而升高，當(dāng)濃度達(dá)到1.5 mg/mL后，濃度的改變對(duì)清除效果的影響較小，紫甘薯花青素濃度為2.5 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到最高，為54.89%。

圖5 不同濃度的花青素清除·OH

2.2.2 清除O2-能力

O2-是高等生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧之一，O2-的異常產(chǎn)生會(huì)直接或間接地?fù)p傷細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體衰老，發(fā)生炎癥甚至癌癥及某些自由基疾病。不同濃度的花青素對(duì)O2-清除率的影響見圖6。由圖6可知，紫甘薯花青素清除O2-的能力隨著濃度的增加而升高，當(dāng)濃度達(dá)到2.0 mg/mL后，濃度的改變對(duì)清除效果影響較小。紫甘薯花青素濃度為2.5 mg/mL時(shí)，清除率最高，為57.67%。

圖6 不同濃度的花青素清除O2-

2.2.3 清除DPPH能力

DPPH是一種穩(wěn)定存在的自由基，通過(guò)檢測(cè)生物試劑對(duì)DPPH的清除能力可以表示其抗氧化性的強(qiáng)弱。不同濃度的花青素對(duì)DPPH清除率的影響見圖7。由圖7可知，紫甘薯花青素在低濃度下清除DPPH效果較好，花青素濃度為1 mg/mL時(shí)，清除率高達(dá)99.08%。之后隨著濃度的增加清除效果變差。

圖7 不同濃度的花青素清除DPPH

3 結(jié)論

微波輔助法最佳提取條件為：汽化劑75%乙醇、紫甘薯與汽化劑比1:1.6（g：mL），微波功率288 W，微波時(shí)間15 s，在此條件下提取率為86.7%。紫甘薯花青素具有較高的清除·OH、O2-和DPPH的能力，花青素濃度為2.5 mg/mL時(shí)，清除·OH和O2-能力分別為54.89%、57.67%；花青素濃度為1 mg/mL時(shí)，清除DPPH能力高達(dá)99.08%，表明紫甘薯花青素具有較好的抗氧化性，作為天然色素其開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。