桿菌肽鋅產品中揮發性雜質來源考察與研究

趙建強，韓靜

（1.沈陽藥科大學，遼寧沈陽 117004；2.華北制藥華勝有限公司，河北石家莊 052160）

桿菌肽鋅（Bacitracin Zinc）屬于多肽類抗生素，是桿菌肽A、B1、B2、B3的鋅鹽混合。桿菌肽鋅是由地衣芽孢桿菌經生物發酵獲得的代謝物，經GC檢測證實：桿菌肽鋅中除了含有工藝當中引入的有機溶劑外，還殘留多個其他揮發性雜質。多篇文獻報道過微生物發酵過程可產生揮發性雜質，其中梁華正[1]采用質譜對微生物揮發性代謝產物進行過研究。通過GC-MS，確證了桿菌肽鋅產品中殘留的主要揮發性雜質，其中主要包括甲醇（RRT 0.44）、乙醇（RRT 0.50）、丙酮（RRT 0.56）、2-丁酮（RRT 0.77）、二甲基丁腈（RRT 1.38）等。本文結合細菌類微生物代謝特征，從培養基引入、微生物代謝產物以及產品降解等方面，系統的考察分析了桿菌肽鋅產品中揮發性雜質的主要來源。

1 材料和方法

1.1 試驗試劑和儀器

發酵用培養基、各步中間體和成品均由華北制藥華勝有限公司提供，分析用試劑均為分析純。

主要儀器：分析天平（萬分之一）、安捷倫GC色譜儀（Agilent，DB-5毛細管柱）。

1.2 試驗方法

確定某批發酵罐，從發酵培養基準備開始，取混合后的培養基，用GC色譜儀進行檢測。按照生產要求在培養基內接入地衣芽孢桿菌，經發酵培養獲得發酵液，放至過濾進行酸化、過濾等預處理得到中間體1，再經提取、純化、精制、結晶及干燥等工藝過程，分別獲得中間體2、中間體3、中間體4、中間體5及最終桿菌肽鋅成品。再用GC色譜儀分別檢測培養基、發酵液、各步中間體和成品，考察各揮發性雜質在工藝流程中產生或去除的趨勢。（注：中間體的揮發性雜質含量是指GC圖譜中各揮發性雜質峰面積所占圖譜面積總和的比例。）

2 結果與討論

2.1 甲醇（RRT 0.44）來源分析

成品中揮發性雜質甲醇的趨勢如圖1。從雜質追蹤趨勢分析可知，成品檢測出的甲醇，自發酵培養基就存在，而且含量較高，在之后的提取、純化工序逐步降低，而在成品中出現回升，推測該雜質是發酵培養基引入的揮發性雜質，同時產品也可降解產生該雜質。

2.2 乙醇（RRT 0.50）來源分析

成品中揮發性雜質乙醇的趨勢如圖2所示。從雜質追蹤趨勢分析可知，成品檢測出的乙醇，自發酵培養基就存在，在發酵結束獲得的發酵液、中間體1中維持在較高水平，后經經提取、純化工序，中間體3中所含乙醇含量逐步降低至較低水平，推測為該揮發性雜質是主要由發酵培養基引入，并在提取后工序能夠有效去除。

2.3 丙酮（RRT 0.56）來源分析

成品中揮發性雜質丙酮的趨勢如圖3所示。從雜質追蹤趨勢分析可知，成品檢測出的丙酮，自發酵培養基就存在，在之后的提取、純化工序逐步降低，而在成品中出現存在回升現象，推測為該雜質是發酵培養基引入的揮發性雜質，同時產品也可降解產生該雜質。在生產中間體2工序時物料為堿性，推測可能是產品在堿性條件下的降解產物。

2.4 2-丁酮（RRT 0.77）來源分析

成品中揮發性雜質2-丁酮的趨勢如圖4所示。從雜質追蹤趨勢分析可知，成品檢測出的2-丁酮在發酵培養基中不存在，發酵培養結束后出現該雜質，含量較高，再經提取、純化等過程，該揮發性雜質可除去大部分，推測該雜質為發酵過程微生物代謝產生的揮發性雜質。

圖1 揮發性雜質（甲醇）趨勢圖

圖2 揮發性雜質（乙醇）趨勢圖

圖3 揮發性雜質（丙酮）趨勢圖

圖4 揮發性雜質（2-丁酮）趨勢圖

2.5 二甲基丁腈（RRT 1.38）來源分析

成品中揮發性雜質二甲基丁腈的趨勢如圖5所示。從雜質追蹤趨勢分析可見，成品檢測出的二甲基丁腈雜質（RRT 1.38），在中間體3生產過程首次產生，但殘留水平較低，后工序可將該雜質有效去除，成品中該雜質出現升高趨勢，推測該雜質是干燥過程因高溫降解產生的揮發性雜質。

2.6 培養基引入揮發性雜質考察

為追蹤考察發酵培養基中發現的可揮發性雜質，結合地衣芽孢桿菌發酵培養基種類進行了排查，經查閱文獻發現，在桿菌肽鋅發酵過程所用培養基黃豆餅粉存在多種揮發性物質。因此用GC色譜儀方法對發酵培養基用黃豆餅粉進行了檢測，檢測結果見表1，黃豆餅粉中主要揮發性雜質分布如圖6所示。

表1 黃豆餅粉試驗考察數據表

檢驗數據表明，培養基產生的揮發性物質甲醇（RRT 0.44）、乙醇（RRT 0.50）和丙酮（RRT 0.56）與文獻報道的黃豆餅粉中揮發性物質基本相符[2]，同時黃豆餅粉中未檢出2-丁酮和二甲基丁腈兩種揮發性雜質，這與桿菌肽鋅揮發性雜質流程考察結果一致[3]，結果證實，培養基消后產生的揮發性物質主要來源于黃豆餅粉。

圖6 黃豆餅粉中主要揮發性雜質分布圖

3 結論

通過對桿菌肽鋅生產工藝流程考察、黃豆餅粉考察，證實甲醇、乙醇、丙酮主要來源于發酵培養基引入；產品堿性條件下降解也可產生丙酮；2-丁酮主要是發酵微生物代謝產生的揮發性雜質；二甲基丁腈主要為干燥過程因高溫降解產生的揮發性雜質。以上考察數據為進一步采取有效措施，降低揮發性雜質引入來源和控制工藝過程降解提供了思路[4-5]。