荷葉堿在青霉菌培養(yǎng)基中抑菌效果的研究

李帆

（安慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，安徽安慶 246052）

在高校微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，菌種污染是一個(gè)普遍存在的現(xiàn)象，一直困擾著教師和科研工作者，嚴(yán)重影響了教學(xué)效果。選擇含有抗菌藥物的培養(yǎng)基可以有效地抑制雜菌的生長(zhǎng)[1]。荷葉堿（Nuciferine，NF）系從荷葉中提取的一種阿樸啡類(lèi)生物堿，其為荷葉的主要活性成分之一，Li[2]等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，荷葉堿能夠顯著抑制細(xì)菌和酵母菌的繁殖和增長(zhǎng)，對(duì)霉菌的抑制作用較弱，這主要是因?yàn)楹扇~堿抑制了酵母和細(xì)菌的有絲分裂，但霉菌除了進(jìn)行無(wú)性繁殖外還進(jìn)行有性繁殖，因此對(duì)其生長(zhǎng)繁殖的抑制作用不明顯。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)藥敏試驗(yàn)檢驗(yàn)不同濃度的荷葉堿營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)青霉菌和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境細(xì)菌的抑菌效果，為制備具有抑菌效果的青霉菌培養(yǎng)基提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

青霉菌由合肥師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存；大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離保存；枯草芽胞桿菌（ATCC6633，南京便診生物科技有限公司）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司）；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基（上海柯瑪嘉生物科技有限公司）；荷葉堿（分析純，上海源葉生物科技有限公司）；定性濾紙（中速，泰州市濾紙廠）；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP型（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；高壓蒸汽滅菌器YX-280D+（合肥市華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；紫外燈2537A型（江蘇申星光電醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分離、純化、鑒定污染青霉菌培養(yǎng)基的細(xì)菌

青霉菌培養(yǎng)過(guò)程中可能污染培養(yǎng)基的細(xì)菌主要來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室教學(xué)用的其他菌種和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境雜菌。其中，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境雜菌主要來(lái)源于空氣、實(shí)驗(yàn)人員包括教師和學(xué)生的手指皮膚以及實(shí)驗(yàn)室桌面；而本實(shí)驗(yàn)室教學(xué)用菌種主要有青霉菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境雜菌的標(biāo)本采集方法如下：采用空氣沉降法收集實(shí)驗(yàn)室空氣標(biāo)本；隨機(jī)采集安慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校護(hù)理、藥學(xué)、臨床3個(gè)不同專(zhuān)業(yè)10個(gè)班級(jí)20名同學(xué)和所有授課教師共6名的手指皮膚樣本，接種于血平板；實(shí)驗(yàn)桌面標(biāo)本采用無(wú)菌棉拭子法。所有標(biāo)本置37 ℃恒溫箱中培育24 h，選擇優(yōu)勢(shì)菌株經(jīng)形態(tài)結(jié)構(gòu)、16S rDNA鑒定確定其分類(lèi)地位。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

（1）荷葉堿抗菌藥紙片制作。將定性濾紙用打孔機(jī)打成6 mm直徑的圓形小紙片50片，分裝在2支清潔干燥的小試管中，高壓蒸汽滅菌后，置于恒溫培養(yǎng)箱中45 ℃干燥。在小試管內(nèi)加入濃度為7 U/L荷葉堿藥液0.25 mL，小心翻動(dòng)紙片，使各紙片充分浸透藥液。同時(shí)在瓶口上記錄藥物名稱(chēng)，放恒溫培養(yǎng)箱中45 ℃干燥后即密蓋，置冰箱冷凍室存放備用，有效期6個(gè)月。（注：1U（萬(wàn)單位）=10mg）

（2）藥敏試驗(yàn)（紙片法）。將青霉菌、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境雜菌密集劃線法接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，將自制荷葉堿抗菌藥物紙片貼于平板中央，青霉菌28 ℃培養(yǎng)48 h，細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)24 h后，記錄抑菌圈直徑，檢測(cè)其對(duì)荷葉堿的藥物敏感度。

1.2.3 荷葉堿抑菌濃度

配制每升含1 U、3 U、5 U、7 U、9 U、11 U、13 U、15 U、17 U、19 U和21 U不同濃度荷葉堿的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，制成平板。將青霉菌和可能污染青霉菌培養(yǎng)基的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境雜菌分別接種于平板上，青霉菌28 ℃培養(yǎng)48 h，細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察記錄生長(zhǎng)情況。根據(jù)結(jié)果分析青霉菌耐藥，細(xì)菌敏感的最低荷葉堿濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境菌種鑒定

空氣、手指皮膚和實(shí)驗(yàn)桌面標(biāo)本經(jīng)37 ℃恒溫箱中培育24 h后，得到3株優(yōu)勢(shì)菌株，分別命名為B1、B2、B3。（1）菌落形態(tài)（圖1）。B1：白色、圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤(rùn)、不透明的菌落；B2：白色、圓形凸起、邊緣整齊、表面粗糙、濕潤(rùn)、不透明的菌落，有草綠色溶血環(huán)；B3：白色、圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤(rùn)、不透明的菌落，有透明溶血環(huán)。（2）革蘭染色（圖2）。B1是G+球菌，B2是G+桿菌，B3是G+球菌。經(jīng)16S rDNA鑒定確定其分類(lèi)地位，見(jiàn)表1。由于本實(shí)驗(yàn)室教學(xué)常用的菌種為青霉菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，因此，實(shí)驗(yàn)教學(xué)中可能污染青霉菌菌種的雜菌主要5種，分別是大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢桿菌和表皮葡萄球菌。

圖1 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境菌種菌落形態(tài)

圖2 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境菌種革蘭染色

2.2 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)的結(jié)果（表2）表明，青霉菌對(duì)荷葉堿耐藥，大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢桿菌和表皮葡萄球菌均對(duì)荷葉堿敏感。荷葉堿可制成藥品[3]，充分發(fā)揮其殺毒、滅菌、降血壓、止痙攣等作用。因此，可將荷葉堿作為本實(shí)驗(yàn)室青霉菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的抑菌藥物。

2.3 荷葉堿最低抑菌濃度

將青霉菌、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢桿菌和表皮葡萄球菌分別接種于不同濃度荷葉堿的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，青霉菌28 ℃培養(yǎng)48 h，細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，培養(yǎng)基中荷葉堿濃度為1～21 U/L時(shí)，青霉菌均能生長(zhǎng)良好，說(shuō)明荷葉堿對(duì)青霉菌沒(méi)有抑菌效果；培養(yǎng)基中荷葉堿濃度高于7 U/L時(shí)大腸桿菌不能生長(zhǎng)；荷葉堿濃度高于13 U/L時(shí)枯草芽孢桿菌不能生長(zhǎng)；荷葉堿濃度高于9 U/L時(shí)科氏/孔氏葡萄球菌不能生長(zhǎng)；荷葉堿濃度高于7 U/L時(shí)高地芽孢桿菌不能生長(zhǎng)；荷葉堿濃度高于11 U/L時(shí)表皮葡萄球菌不能生長(zhǎng)。因此，培養(yǎng)基中荷葉堿濃度高于為13 U/L時(shí)大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢桿菌和表皮葡萄球菌均不能生長(zhǎng)，而青霉菌生長(zhǎng)良好，青霉菌培養(yǎng)基中荷葉堿最低抑菌濃度是13 U/L。

表1 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境優(yōu)勢(shì)菌種鑒定結(jié)果

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表3 不同濃度的荷葉堿培養(yǎng)基中菌種生長(zhǎng)情況

3 結(jié)論

本研究通過(guò)藥敏試驗(yàn)結(jié)果證明，用濃度為13 U/L的荷葉堿營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)青霉菌，能夠有效抑制大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、科氏/孔氏葡萄球菌、高地芽孢桿菌和表皮葡萄球菌生長(zhǎng)。我國(guó)的荷葉資源豐富[4]，價(jià)格低廉且易得，故對(duì)荷葉堿在培養(yǎng)基中的抑菌效果研究具有很大的現(xiàn)實(shí)意義。