解磷菌培養的代謝產物初步研究

李文謙，盧康，茅燕勇，陳大兵

（1.淮陰工學院，江蘇淮安223003；2.淮安市三商農業科技有限公司，江蘇淮安223300）

磷是植物生長不可或缺的營養物質之一，對于植物的代謝生長起著重要的促進作用[1]。但是，土壤中能被植物直接吸收促進其生長的磷的含量非常低，且植物能吸收利用的有效磷量很少，不到土壤中所有磷的1%[2]。解磷微生物能夠將土壤中不能吸收利用的磷轉化為可吸收利用的磷，提高土壤中植物可利用磷的含量。另外，它可使土壤中的一些微量元素成為可促進植物生長的形式，如鐵、鋅等[3-5]。解磷微生物能轉化可溶磷的原因，主要是其在代謝過程中產生了多種有機酸，如草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等，與此同時，有機酸和一些微量元素螯合，使得營養物質pH下降，酸度升高，磷酸鹽得以溶解[6-7]。另外，解磷微生物代謝過程中分泌的磷酸酶、蛋白質、多糖等，也可能與解磷微生物的解磷效果有關[8]。本文采用在淮安果園土壤中篩選獲得的高效解磷菌，對其發酵培養，測定發酵液中的有機酸濃度、磷酸酶活性、蛋白質含量、多糖含量等，初步研究該解磷菌的代謝產物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌，為實驗室篩選解磷菌。

1.1.2 培養基

活化培養基（LB培養基）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，加入去離子水1L，pH 7.0。

發酵培養基：10g，硫酸銨5g，氯化鈉0.3g，氯化鉀0.3g，七水合硫酸鎂0.3g，七水合硫酸亞鐵0.03g，一水合硫酸錳0.03g，磷酸二氫鉀（磷酸三鈣或卵磷脂等）2g，定容至1000mL，，pH7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 有機酸含量的測定

用量筒準確量取10mL經過10000r/min離心10min的發酵液，轉移到100mL的容量瓶中，用去離子水定容、搖勻，待用。準確吸取稀釋樣液20mL于150mL三角瓶中，加入1%的酚酞2滴，用裝有0.05mol/L的氫氧化鈉的堿式滴定管滴定，滴定直至溶液的顏色剛剛顯粉色，30s內不褪色就完成滴定，記下滴定所用的氫氧化鈉的體積。有機酸含量(%)=kcV/10×100%，式中，c為NaOH濃度 (mol/L)，k為換算系數，取0.064，V為消耗NaOH液量(mL)。3次重復，取平均值。

1.2.2 磷酸酶活性的測定

標準曲線的制作:分別吸取標準對硝基酚溶液0、l、2、3、4、5ml于試管中，定容至5ml。加1mL的0.5mol/L的氯化鈣溶液和4mL的0.5mol/L氫氧化鈉溶液,420nm比色。繪制標準曲線，計算標準曲線的回歸方程及R2值：Y=0.6688X-0.0008 (R2=0.9997)。

用移液槍吸取1mL經過10000r/min離心10min的發酵上清液于干凈試管中，加入4mL MUB(檢測酸性磷酸酶時所用的MUB試劑的pH為6.5，檢測堿性磷酸酶時所用的MUB試劑的pH為11），再加用相同pH的緩沖液配制成的1mL對硝基苯磷酸二鈉溶液，振蕩幾秒鐘混勻，塞住瓶塞，在恒溫培養箱中37℃培養1 h，取出打開瓶塞，分別加入1mL的0.5mol/L的氯化鈣溶液和4mL的0.5mol/L氫氧化鈉溶液，震蕩后用濾紙過濾懸液，將澄清濾液在420nm處比色，。由標準曲線換算得相應的磷酸酶活性。

1.2.3 多糖、蛋白質含量測定

分別采用硫酸-苯酚法、考馬斯亮藍法測定發酵液中的多糖、蛋白質含量[9-10]。

用分析天平準確稱取標準葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加去離子水定容至刻度，搖勻。分別吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 及 0.9ml該溶液于比色管中，各以去離子水補至1.0ml，然后各加入6%的苯酚0.5ml及濃硫酸2.5ml，搖勻冷卻，室溫放置20min后，于490nm處測吸光度值以1ml去離子水為空白組按上述操作調零。以多糖微克數為橫坐標，縱坐標為吸光度值，繪制標準曲線。計算標準曲線的回歸方程及R2值：Y=10.029X-0.0095(R2=0.994)。將發酵液離心取0.2ml上清液，按上述標準曲線中的操作方法測定，以上述空白組調零，在490nm處測吸光度值，然后按回歸方程計算待測溶液中的多糖濃度。

取6支比色管分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的0.1mg/ml的標準蛋白質溶液，再各用去離子水補齊至1ml,后分別加入5ml考馬斯亮藍溶液，混合均勻，靜置5min后用1cm光徑比色杯在595nm下比色，一小時內完成比色。橫坐標為蛋白質濃度，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。計算標準曲線的回歸方程及R2值：Y=4.9543X+0.006(R2=0.999)。發酵液離心1ml上清液，加入5ml考馬斯亮藍溶液，搖勻靜置5min，以上述空白管調零，于595nm處比色，由標準曲線計算發酵液中的蛋白質濃度。

1.2.4 可溶性磷含量的測定

用移液管分別準確吸取5mg/L的磷標準溶液0、2、4、6、8、10ml于潔凈的1-6號50ml容量瓶中，用去離子水補齊至10ml，再加入二硝基酚指示劑2-3滴，并用100g/L氫氧化鈉溶液調節至溶液剛呈微黃色，用移液槍準確加入5ml鉬銻鈧顯色劑，搖勻，加去離子水定容，于室溫15℃以上，放置30min。在波長700nm處，測定其吸光度，以吸光度值為縱坐標，磷濃度(mg/L)為橫坐標，繪制標準曲線。計算標準曲線的回歸方程及R2值：Y=0.4956X+0.0027(R2=0.999)。

將待測發酵液經10000r/min離心10min，取2mL上清液移至50mL容量瓶中，用水稀釋至總體積約3/5處，滴加二硝基酚指示劑1～2滴，并用100g/L氫氧化鈉溶液調節至溶液剛呈微黃色，用移液槍準確加入5mL鉬銻鈧顯色劑，搖勻，加去離子水定容，室溫15℃以上，放置30min。顯色的發酵液進行比色測定，讀取吸光度值，再由回歸方程計算得相應的含磷量[11]。

2 結果與分析

2.1 不同磷源發酵液中有機酸濃度的變化

有機酸是一類酸性有機化合物，能夠解離出游離的氫離子，氫離子和磷酸根結合形成可溶性磷酸鹽，同時，有機酸根離子能夠與金屬離子結合從而釋放無機磷。不同磷源發酵液中有機酸濃度的變化如圖1所示，3種磷源的發酵液中的有機酸濃度都隨發酵時間延長而出現一定程度的上升，但空白無磷源的發酵液中的有機酸含量遠小于有磷源的發酵液中的有機酸含量。以磷酸鈣為唯一磷源時的發酵液中有機酸含量最高，達33.1mg/L。

圖1 不同時間段磷源的發酵液中有機酸濃度

2.2 不同磷源發酵液中磷酸酶活性的變化

酸性磷酸酶能夠從不同的有機磷底物上水解磷酸基團，釋放出無機磷供植物吸收利用。堿性磷酸酶可以催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應，生成無機磷酸和相應的醇、酚、糖等，促進植物生長繁殖。不同磷源發酵液中磷酸酶活性的變化如圖2和圖3所示，隨著發酵的進行，不同磷源中的磷酸酶活性均呈現緩慢下降趨勢。無磷源的發酵液中磷酸酶活性較低，有磷源的發酵液中的磷酸酶活性遠高于無磷狀態，其中以磷酸二氫鉀和磷酸鈣為磷源時的發酵液中磷酸酶活性相差不大，但以卵磷脂為唯一磷源時的磷酸酶活性則明顯高于兩者。這說明磷酸酶的活性在發酵初期比較高，隨著發酵的時間的增長，磷酸酶活性緩慢下降，因此磷酸酶是枯草芽孢桿菌的解磷物質，與解磷效果密切相關，但主要作用在解磷前期。

2.3 不同磷源發酵液中多糖含量的變化

由圖4可知，不同磷源條件下，枯草芽孢桿菌均產生一定濃度的多糖，發酵液中多糖含量呈先下降后上升的趨勢。其中以卵磷脂為唯一磷源時的多糖含量最高，達54.2mg/L。枯草芽孢桿菌溶解有機難溶磷產生的多糖高于溶解無機難溶磷。

2.4 不同磷源發酵液中蛋白質濃度的變化

添加不同種類磷源條件下培養枯草芽孢桿菌一定時間，測定其蛋白質濃度，結果見圖5。由圖5可知，在3種不同磷源條件下，以卵磷脂為唯一磷源時的蛋白質濃度最高，為51mg/L，而空白不含磷源的發酵液中的蛋白質含量極低，僅有10.1mg/L。這就表明蛋白質可能也是枯草芽孢桿菌溶解難溶磷的重要代謝產物之一，影響著枯草芽孢桿菌的解磷效果。

圖2 不同時間段磷源發酵液中酸性磷酸酶活性

圖3 不同時間段磷源發酵液中堿性磷酸酶活性

圖4 不同時間段磷源發酵液中多糖含量

2.5 不同磷源發酵液中磷含量的變化

在不同磷源條件下發酵液中可溶性磷含量如圖6所示。由圖6可見，發酵液中磷含量都呈上升趨勢，空白無磷的發酵液中可溶磷含量最低，僅達到0.041mg/L，以卵磷脂為唯一磷源的可溶磷含量最高，達0.956mg/L。說明枯草芽孢桿菌對不同形態的難溶磷的溶解能力存在差異。

3 結論

在外界磷源的誘導下，解磷菌在代謝過程中產生有機酸而發揮其溶解外界磷元素的能力。本文對不添加磷源、磷酸二氫鉀、碳酸鈣和卵磷脂4種不同培養基中解磷菌的代謝產物進行了比較分析，發酵液中有機酸含量最高為33.1mg/L，酸性磷酸酶含量最高達242.6μmol/(L·h)，多糖含量最高達54.2mg/L，蛋白質含量最高達51mg/L，磷含量最高達0.956mg/L。

圖5 不同時間段磷源發酵液中蛋白質濃度

圖6 不同時間段磷源發酵液中磷含量