血三七中巖白菜素的分離鑒定及抗氧化研究

陳翱天，李書華

（1.四川省樂山第一中學校，四川樂山 614000；2.樂山師范學院 化學學院，四川樂山 614000）

血三七是蓼科植物中華抱莖蓼（Polygonum amplexicaule var. sinense）的干燥根莖[1]，具有清熱解毒、止痛散瘀和止血的功效，可用于治療骨折、外傷出血、跌打損傷等[2]，為苗族和土家族常用藥。現代藥理研究表明，血三七具有抗氧化[3]、抗菌[4]和治療動脈粥樣硬化[5]等多種藥理作用。目前，血三七的化學成分研究表明，血三七主要含有黃酮類、蒽醌類及酚酸類化合物[6]，這些化合物分別具有抗氧化[3]、抗病毒[7]、抗菌[8]和鎮痛[9]等多種作用。

為了進一步研究血三七的化學成分，以血三七粉末為原料，采用95%乙醇室溫浸提，50 ℃減壓濃縮后得到無醇水液，用乙酸乙酯除脂后，得到血三七的除脂醇提液。將此除脂醇提液濾膜過濾后，通過制備液相分離，得一單一組分，將該單一組分濃縮后結晶，得到單體化合物。通過核磁共振技術鑒定該單體化合物為巖白菜素，并以維生素C作為陽性對照，采用清除DPPH自由基試驗方法研究該化合物的抗氧化活性，探討了其抗氧化機理，展望巖白菜素作為抗氧化劑在食品領域的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

血三七，購自安徽亳州中藥材市場。DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），購自北京中生瑞泰科技有限公司。維生素C，購自上海源葉生物科技有限公司。RE-301旋轉蒸發儀（河南鞏義瑞德儀器廠），Waters色譜儀，GeLai制備液相色譜，Varian INOVA 400核磁共振譜儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 巖白菜素的提取與制備

將2.00 kg干燥的血三七根粉碎，用6 L乙醇（95%）室溫浸泡提取72 h，過濾；濾渣再次用6 L乙醇（95%）室溫浸泡提取72 h，過濾，合并濾液。在減壓及50 ℃條件下濃縮濾液至無醇水液；然后用500 mL乙酸乙酯萃取兩次，除去脂溶性成分，得到血三七的除脂醇提液。將該除脂醇提液過濾處理，經中壓制備液相色譜儀制備分離，按照各峰收集洗脫液，濃縮各洗脫液至干，甲醇溶解，放置結晶，待晶體析出，過濾，即得到純品化合物，并以分析液相檢測該化合物的純度。

1.2.2 巖白菜素的結構鑒定

以氘代甲醇為溶劑，用Varian INOVA 400核磁共振譜儀進行核磁測試，解析核磁共振氫譜和碳譜圖，得到化合物的結構。

1.2.3 抗氧化性能的測定

根據文獻[10]，采用DPPH清除率法，以維生素C為陽性對照，研究純品化合物巖白菜素的抗氧化活性。

1.2.4 數據分析

抗氧化性能的測定試驗中，以維生素C作為陽性對照，以空白為分光光度計調零，做3組重復，抗氧化性能取3組實驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 巖白菜素的制備

將用2.00 kg干燥的血三七獲得的除脂醇提液濃縮至80 mL，加入20 mL甲醇搖勻，配制成100 mL溶液，將該溶液先用普通濾紙過濾，濾液再用0.45 μm的濾膜過濾，得到樣品的制備液。將樣品的制備液一次性吸入制備液相色譜柱，以乙腈-水為流動相梯度洗脫，運行時間60 min；0 min時，乙腈含量為5%，60 min時，乙腈含量為60%；流速20 mL/min，檢測波長275 nm。按照峰收集洗脫液，濃縮各個峰的洗脫液，濃縮干后，用甲醇溶解，放置，結晶，過濾，得到小顆粒狀無色晶體，待晶體干燥后稱重3.2 g。以分析液相色譜儀檢測該化合物純度為98.5%（檢測條件：檢測波長275 nm，流速1 mL/min，洗脫液為乙腈-水，設定時間為20 min，0 min時，乙腈比例為5%，20 min時，乙腈比例為40%），如圖1所示。

圖1 巖白菜素的HPLC純度

2.2 巖白菜素的鑒定

通過核磁測試得到該化合物的核磁共振氫譜圖，如圖2所示。從核磁共振氫譜（1H-NMR，CD3OD）可以看出，δ 7.07（1H, s, H-7），δ 4.94（1H,d, J=12 Hz, H-10b），4.07 (1H, d, J=8 Hz, H-4a)，4.03(1H, d, J=8 Hz, H-11)，3.90（3H, s, -OCH3），3.82 (1H,t, J=8 Hz, H-4)，3.70（1H, m, H-11），3.66（1H, m,H-2），3.44（1H, t, J=8 Hz, H-3)。通過核磁測試得到該化合物的核磁共振碳譜圖，如圖3所示。由核磁共振碳譜（13C-NMR，CD3OD）可以看出，該化合物有14個碳，其化學位移分別為δ 164.3（C-6），150.9（C-8），148.0（C-10），140.8（C-9），118.0（C-6a），115.8（C-10a），109.6（C-7），81.6（C-2），79.9（C-4），74.2（C-4），72.8（C-10），70.4（C-3），61.2（C-11）和59.5（C-12）。綜合氫譜和碳譜數據可知該化合物與文獻[11]報道的巖白菜素一致，故將該化合物鑒定為巖白菜素，其結構如圖4所示。

2.3 巖白菜素的DPPH自由基清除試驗結果

巖白菜素和維生素C對DPPH自由基的清除率結果如圖5所示。從圖5可以看出，巖白菜素、維生素C對DPPH均具有很強的清除作用，化合物濃度越高清除率越大，巖白菜素的抗氧化能力強于陽性對照維生素C。巖白菜素的體系終濃度IC50為0.245 μg/mL，而維生素C的體系終濃度IC50為0.575 μg/mL，從其IC50來看，巖白菜素的抗氧化活性強于比維生素C。

圖2 巖白菜素的核磁共振氫譜

圖3 巖白菜素的核磁共振碳譜

圖4 巖白菜素的結構

圖5 巖白菜素對DPPH的清除曲線（n=3）

巖白菜素的抗氧化活性強弱與化合物結構中的酚羥基有關，其可能的抗氧化機理如圖6所示。

3 結論

文獻報道中華抱莖蓼的生理活性較多，其主要的活性物質為蒽醌、綠原酸等化合物。而本文的實驗數據表明，中華抱莖蓼根中巖白菜素含量較高，該化合物具有較強的抗氧化活性，其清除DPPH自由基的體系終濃度IC50為0.245 μg/mL，低于維生素C的體系終濃度（IC500.575 μg/mL），說明巖白菜素的抗氧化活性高于維生素C，預示了富含巖白菜素的中華抱莖蓼還具有抗氧化的新活性，同時巖白菜素的較強抗氧化活性表明其在食品天然抗氧化劑領域和醫藥保健行業具有潛在的應用價值。

圖6 巖白菜素的抗氧化機理