真菌菌體直接PCR擴增的方法研究

林艷云，陳憶婷，黃曉明，林峻＊

（1.福州大學 至誠學院，福建福州 350001；2.福州大學 生物科學與工程學院，福建福州 350108）

真菌的種類繁多，既有對人類生產生活有益的真菌，同時也有對人類健康有害的病原真菌[1]。真菌與其他微生物共同作用，對生態環境具有重要的作用，能夠保持生態系統中有序的物質循環和能量流動[2]。真菌可以作為生態系統的分解者[3]，具有生物防治病原體[4]、富集重金屬[5-6]、降解農藥[7-8]等多種作用。現今人們進一步加大對真菌資源的開發利用，例如利用黑曲霉代謝系統及產酶系統來生產檸檬酸[9]、木聚糖酶[10]、淀粉酶[11]等；米曲霉可作為發酵調味品的生產菌株[12]，普遍用于蛋白酶和淀粉水解酶的生產，同時它被美國食品與藥品管理局認定為安全微生物菌種[13]；利用里氏木霉的代謝特點可將木質纖維轉化為生物質原料[14]，生產可再生能源，不僅能實現對廢物的再利用，也能提供新型能源。對這些重要的生產用真菌的生產控制，科研人員不僅從代謝調控和發酵條件等方面進行優化，也從基因工程的角度對其進行改造，如構建食品級木聚糖酶黑曲霉工程菌[15]。在對真菌進行基因改造時，難以避免需要對真菌基因組進行提取，而傳統的真菌基因組提取方法較為繁瑣，因此本文以黑曲霉513.88（Aspergillus niger 513.88），米曲霉 2397（Aspergillus oryzae 2397），尼崎青霉（Penicillium amagasakiense），里氏木霉（Trichoderma reesei）作為研究對象，研究并探討了一種能夠簡便快速提取真菌基因組，并且對其進行直接PCR擴增的方法，這能夠為真菌基因組的快速提取與擴增提供另一種思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑曲霉513.88、米曲霉2397、尼崎青霉、里氏木霉，均由福州大學應用基因組學研究所提供。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器

臺式高速離心機（Eppendorf 5430），梯度PCR儀（Biosafer 9700），電熱恒溫水浴鍋（HWS12型），超微量核酸光度計（Nanodrop 2000），生化培養箱（BPC-70F），全自動凝膠成像分析儀（JS-680D）。

1.2.2 主要試劑

康為世紀2×Taq PCR mix，Takara 250 bp DNA Ladder Marker，λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker，液氮，生工生物工程（上海）有限公司真菌基因組DNA快速提取試劑盒，A公司產細胞裂解液，B公司產細胞裂解液，實驗室自制細胞裂解液。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種培養

將菌種接種于PDA培養基中，30 ℃恒溫培養，直至單菌落形成。

1.3.2 液氮研磨法提取基因組

收集瓊脂平板上的真菌菌體，在研缽中用液氮快速研磨，形成粉末，然后使用真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取真菌DNA，對提取得到的產物做瓊脂糖凝膠電泳，進行進一步驗證。

1.3.3 裂解液提取基因組

用無菌槍頭挑取菌落，分別加入到50 μL A公司細胞裂解液、B公司細胞裂解液、實驗室自制裂解液中，進行裂解，其裂解條件為：A公司細胞裂解液（80 ℃，5 min），B公司細胞裂解液（80 ℃，15 min），實驗室自制裂解液（85 ℃，15 min）。

1.3.4 PCR引物

用于擴增在真菌中保守的18s rRNA基因的PCR引物設計如下：

18sF：5'-GAGCG GATAA CAATT TCACA CAGG-3'

18sR：5'-CGCCA GGGTT TTCCC AGTCA CGAC-3'

1.3.5 PCR

將裂解后的產物進行直接PCR，反應體系為：3 μL裂解產物，上游引物1μL，下游引物1 μL，引物濃度為 10 μmol/L，2×Taq PCR mix 25 μL，無菌水20 μL，PCR擴增循環程序為：預變性94 ℃，10 min；變性 94 ℃ 30 s，退火 53 ℃ 30 s，延伸 72 ℃90 s，35個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR結束后，取PCR反應液做瓊脂糖凝膠電泳，以便進一步驗證。

1.3.6 PCR結果測序及產物序列比對

將PCR產物送交安徽通用生物系統有限公司進行Sanger測序，并使用Blast生物信息學分析工具，對測序得到的DNA序列進行分析。

2 結果與分析

2.1 液氮研磨法提取基因組DNA結果分析

經液氮研磨，真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取得到的產物，其瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1、圖2所示。由圖可知，該試劑盒能夠成功提取到4種真菌的基因組DNA，但里氏木霉和米曲霉2397有拖帶現象，提示所提取的基因組DNA有部分降解。

圖1 黑曲霉513.88基因組DNA抽提結果

圖2 里氏木霉、尼崎青霉、米曲霉2397基因組DNA抽提結果

2.2 液氮研磨產物PCR擴增結果分析

液氮研磨產物經試劑盒提取后進行PCR擴增，結果如圖3所示。4種真菌均有目的條帶，里氏木霉、尼崎青霉、黑曲霉513.88的擴增條帶明亮，試劑盒抽提效果好，但是米曲霉2397 PCR擴增條帶較暗，可見該試劑盒對米曲霉2397基因組提取效果不佳。

圖3 液氮研磨產物PCR擴增結果

2.3 黑曲霉513.88裂解產物直接PCR擴增結果分析

對黑曲霉513.88進行裂解液處理并直接PCR后，產物電泳結果如圖4所示。目的條帶為1 634 bp，1、2、3泳道在1 500～2 250 bp有清晰條帶，可見使用3種裂解液都能提取到黑曲霉513.88的基因組DNA并成功進行后續的PCR擴增。

圖4 黑曲霉513.88基因組直接PCR擴增結果

2.4 黑曲霉513.88 PCR擴增產物測序分析

經過Sanger法測序，測序得到單峰峰圖，對該測序結果在NCBI網站進行Blast比對，與Aspergillus niger的基因組序列相似度為99%，PCR擴增產物可以確定為黑曲霉的基因組DNA。

2.5 米曲霉2397裂解產物直接PCR擴增結果分析

PCR電泳產物檢測結果如圖5所示。電泳結果沒有目的條帶，可見此法并不適用于米曲霉的基因組提取與擴增。

圖5 米曲霉2397基因組直接PCR擴增結果

2.6 尼崎青霉裂解產物直接PCR擴增結果分析

尼崎青霉PCR產物電泳檢測結果如圖6所示。電泳結果沒有條帶，可見此法并不適用于尼崎青霉的基因組提取與擴增。

圖6 尼崎青霉基因組直接PCR擴增結果

2.7 里氏木霉裂解產物直接PCR擴增結果分析

分別采用3種裂解液裂解里氏木霉，其基因組PCR擴增結果如圖7所示。第1、2、3泳道在1 500～2 250 bp有條帶。但使用實驗室自制裂解液提取的基因組擴增產物條帶明亮，A公司細胞裂解液裂解效果次之，B公司細胞裂解液基因組擴增產物電泳條帶最暗。

圖7 里氏木霉基因組直接PCR擴增結果

2.8 里氏木霉PCR擴增產物測序分析

里氏木霉PCR產物經過Sanger法測序，測序得到單峰峰圖，在NCBI網站上進行測序結果比對，該菌的基因組序列與Trichoderma reesei的基因組序列相似度為99%，PCR擴增產物可以確定為黑曲霉基因組DNA。

3 結論

PCR擴增能否成功，其重點在于提取的真菌基因組DNA質量的高低。真菌的細胞壁富含多糖等特殊成分，抗逆性強，而要提取到高質量的真菌基因組DNA，關鍵問題就在于破壁的成功。實驗室常用的破壁方法包括液氮研磨法、尿素裂解法、凍融法、打擊震蕩法、氯化芐法和酶消化法等。對于某些真菌，因其細胞壁較為“柔軟”，采用酶消化法就可以實現對真菌的破壁處理，并提取到基因組DNA。但是對于絕大多數的真菌，由于其細胞壁的結構與成分的特殊性，具有較強的耐受性，為了達到良好的破壁效果，就需要應用其他物理方法如超聲波、高壓等共同作用。本方法采用市售常見細胞裂解液對真菌細胞進行直接裂解，結果顯示黑曲霉513.88和里氏木霉這兩種重要的真菌可以在細胞裂解液處理后實現直接PCR擴增，但是對米曲霉2397和尼崎青霉沒有效果。多糖是構成真菌細胞壁的主要成分，對于不同類群的真菌，細胞壁中多糖的類型也會有所不同[16]，可能是由于米曲霉2397和尼崎青霉細胞壁多糖對裂解液成分不敏感，造成破壁困難。同時對于真菌細胞壁來講，細胞壁各成分所占比例與細胞生活周期有關，而細胞壁成分比例的高低又會影響到破壁的難易，當細胞尚處于幼嫩階段，較容易破壁，反之較難破壁[17]，從而導致后續PCR擴增失敗。本研究結果表明，市售的常見細胞裂解液，可以對部分真菌物種實現直接裂解和PCR擴增，若善加利用，可以減少真菌破壁的繁瑣操作，從而簡化對真菌進行基因工程改造的步驟，進一步提高改造的效率。