楊樹切口處不同根序細根內源激素與氮代謝關鍵酶對斷根的響應

劉方春，馬海林*，杜振宇，馬丙堯，井大煒

1. 山東省林業科學研究院，山東 濟南 250014；2. 德州學院資源環境與規劃學院，山東 德州 253023

楊樹（Populus）是溫帶與北亞熱帶地區栽植面積最廣且最為速生的闊葉樹種之一（陳鴻鷹，2017）。但當楊樹林分進入郁閉狀態后，其地下根系便相互交織在一起使楊樹變為“小老樹”，并對根系生長具有明顯的抑制效果（Du et al.，2012）。此時期的根系逐漸衰老，根毛脫落較快，顯著降低了根系的吸收能力（Jing et al.，2017）。斷根是通過改變根系生長來調控植物營養生長與生殖生長以及地上部與地下部過程的栽培方式（Du et al.，2012）。在經濟林栽培中，為了適應果樹矮化密植的需求，經常對蘋果樹（Fang et al.，2017）、冬棗樹（Yang et al.，2012）、桃樹（Jimenes et al.，2018）等采用斷根措施對其營養生長加以控制。同時在水稻（汪強等，2004）、玉米（路篤旭等，2017）、小麥（Liu et al.，2017）等農作物的研究發現，適宜的斷根強度有利于增強根系的吸收能力且增產效應顯著。本研究團隊在前期已運用斷根措施對楊樹郁閉林分開展了大量的探索研究（Du et al.，2012；Jing et al.，2017），發現適度斷根有助于刺激切口處萌發大量細根，并對根際土壤微生態環境有明顯的改善效果。目前眾多學者已針對斷根開展了廣泛的研究（Fang et al.，2017；Jimenes et al.，2018；Yang et al.，2012），但關于楊樹切口處不同根序細根的內源激素與氮代謝規律的研究還鮮見報道。

根系是林木從土壤環境中攝取營養資源的關鍵器官（Du et al.，2012；井大煒等，2017），既是產生植物激素的“源”，又是接受地上部產生的內源激素的“庫”，因此根系能夠調控地上部激素含量，進而在協調地上部莖葉與根系的生長發育過程中發揮十分重要的作用（楊喜田等，2011）。有研究表明（任雪菲等，2013），根系的生理功能絕大部分由細根（<2 mm）完成，且細根的生長特性與狀況會直接影響植物個體的生長發育。隨著研究的不斷深入，愈來愈多的證據顯示細根在植物形態結構與功能上存在明顯的異質性，不同徑級或根序的細根生理功能顯著不同（鄒宇星等，2018）。相關研究發現（李洪娜等，2015），外界因素對植物生長的影響首先是通過改變植物體內激素的含量而起作用，激素可作為林木生長的重要調控物質之一。同時，根系生長發育與細胞的分裂是分不開的，內源激素可能是整合細胞周期與根系發育的關鍵因子（He et al.，2017）。此外，林木的生長對氮素的需求量最大，而硝酸還原酶（NR）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酰胺合成酶（GS）與谷氨酸脫氫酶（GDH）是林木氮素代謝生理的關鍵酶（Liu et al.，2018；井大煒等，2016），影響整個氮代謝的循環體系，在調控氮素從林木體內的內部轉移與再利用及提高氮素利用率方面發揮著十分重要的作用（Meng et al.，2018；楊賢均等，2017）。鑒于此，本研究以郁閉的歐美 I-107楊（Populus euramericana cv. ‘Neva’）為研究對象，探討不同斷根強度對楊樹人工林切口處細根內源激素、氮代謝關鍵酶與材積生長的影響，并分析材積生長率與細根內源激素、氮代謝關鍵酶之間的相關性，旨在剖析切口處不同根序細根的內源激素和氮代謝關鍵酶與林木生長之間的內部聯系，以期為明確楊樹的增產提供實踐依據，也為人工林的高產栽培提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與供試材料

試驗地點設在山東省濟南市北郊林場（117°00'E，36°40'N），春季干旱少雨，夏季溫熱多雨，年平均降雨量、氣溫分別為 650~700 mm、14 ℃。供試土壤為潮土，土壤速效氮、速效磷及速效鉀含量分別為19.59、14.17及45.80 mg·kg-1，總有機碳含量為9.02 g·kg-1。所用化肥為林農習慣使用的尿素、過磷酸鈣與硫酸鉀，肥料用量為常規施肥量，相當于 N 208.15 kg·hm-2，P2O570.26 kg·hm-2與 K2O 56.75 kg·hm-2的施肥水平。楊樹為5年生郁閉的I-107歐美楊，株行距4 m×3 m，南北行向，林木生長均勻，平均樹高、胸徑分別為(12.81±0.27) m、(12.43±0.30) cm。

1.2 試驗設計

試驗于2017年4月10日進行，采用隨機區組設計，每個小區30株樹，重復3次。試驗共設4個處理，分別為：（1）未斷根處理（CK）；（2）6倍胸徑兩側斷根（6-2）；（3）8倍胸徑兩側斷根（8-2）；（4）10倍胸徑兩側斷根（10-2）；各斷根處理分別在距樹干基部6倍、8倍與10倍胸徑處的東西方向垂直地面向下切斷側根與須根。各斷根處理的開溝深度與寬度分別為40 cm與100 cm，并將挖出來的土回填夯實（楊喜田等，2011）。日常管理與大田常規措施保持一致。

1.3 根系采樣和分級

2017年11月6日，在每個小區去掉東西兩側的保護行與南北兩端的邊緣樹，選擇中間的12株樹作為樣樹進行細根采集，重復3次。依據Guo et al.（2004）的完整土塊法用鐵鏟挖取每株樣樹切口處萌發出的根系，并放置在濕紗布中以保持其活性。參照Pregitzer et al.（2002）的分級方法，將根系最末端的根尖定為1級根，兩個1級根相交后的根定為2級根，以此類推；不同等級的根經處理后分別放入相應的玻璃皿中，并冷藏保存（熊德成等，2012），盡快進行內源激素與氮代謝關鍵酶的測定。

1.4 內源激素與氮代謝關鍵酶測定

內源激素測定：由根系浸提得到，采用高效液相色譜法，使用儀器為美國Agilent HP 1100 series型液相色譜儀，紫外檢測波長254 nm，過C18柱（250 mm×4.6 mm），流動相為 V(甲醇)∶V（水，其中含 0.5%醋酸）=45∶55，進樣量 20 μL，流速 1 mL·min-1。外標法定量（楊守軍等，2009）。

氮代謝關鍵酶測定：參照Gangwar et al.（2011）的方法并做了部分改進來測定切口處不同根序細根的硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）與谷氨酸脫氫酶（GDH）活性。其中NR活性采用活體法，加入KNO3-磷酸緩沖溶液后真空干燥，然后吸取上清液并加入磺胺與 α-萘胺后，在 540 nm 波長比色測定，單位為μmol·g-1·h-1；GS 活性的測定是先加入緩沖液后研磨、水浴，加入顯色劑后離心，在540 nm波長比色測定，單位為 μmol·g-1·h-1；GOGAT 活性的測定是分別加入α-酮戊二酸溶液、KCl溶液與Tris-HCl緩沖液后水浴，然后加入NADH、L-谷氨酰胺溶液，在 340 nm 波長比色測定，單位為 μmol·g-1·h-1；GDH活性的測定是先加入儲備液、CaCl2溶液，水浴，然后加入NADH與酶液，在340 nm波長比色測定，單位為 μmol·g-1·h-1。

1.5 材積生長率的計算

在2017年4月10日與2017年11月6日分別測定所有試驗林木的胸徑d與樹高h，并利用公式V=3.14 d2hf/4（f=0.42）計算材積；之后利用普雷斯勒公式（Jing et al.，2017）計算材積平均生長率：

式中，PV表示材積生長率（%）；Vl、V2分別為間隔 n年前與 n年后測得的總材積（m3）；n為兩次測定的間隔年數。

1.6 統計分析

數據處理運用SPSS 23.0軟件，采用One-way ANOVA（單因素方差分析法）與LSD（最小顯著法）在α=0.05水平下檢驗不同斷根處理或不同根序之間楊樹切口處細根內源激素與氮代謝關鍵酶等指標的變化規律。圖 1~4中的數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 內源激素含量

由圖1可知，隨著根序的增加，楊樹切口處不同根序細根的IAA含量呈逐漸降低的趨勢，且各序級之間的差異均達顯著水平。與CK相比，8-2處理1~5級根的IAA含量顯著升高，其平均值分別較CK、6-2與10-2處理顯著提高22.89%、36.04%與21.76%；6-2處理1~2級根的 IAA含量顯著低于CK，而3~5級根與CK差異不顯著；10-2處理1~5級根與CK差異未達顯著水平。

圖1 斷根對楊樹切口處不同根序細根內源激素含量的影響Fig. 1 Effect of root pruning on the contents of endogenous hormone in different orders of fine root in poplar incision數據為平均值±標準差（n=3），同一處理不同小寫字母表示根序間差異顯著（P<0.05）。下同Data is average value±standard deviation (n=3). Different lowercase letters in the same treatment mean significant difference among different root orders(P<0.05). The same as below

GA、ZT與ABA含量呈現出基本一致的變化趨勢，其含量隨著根序等級的增加而升高。其中GA、ZT含量在不同根序之間的差異均達顯著水平，而ABA含量在1~2級根之間的差異不顯著，而3~5級根之間差異達顯著水平。同時可見，8-2處理1~5級根的GA和ZT含量均最高，并顯著高于其他處理，其中GA的平均值相比CK、6-2與10-2處理分別高出20.74%、28.92%與17.50%；10-2處理1~5級根的GA、ZT含量與CK無顯著性差異，而6-2處理1~5級根的GA、ZT含量明顯低于CK。從圖1還可知，6-2處理1~5級根的ABA含量最高，并顯著高于其他處理；其次為CK與10-2處理，二者無顯著性差異，但均顯著高于8-2處理。數據分析可知，斷根對楊樹切口處不同根序細根的內源激素含量具有明顯的影響效果，其中8-2處理能顯著提高各序級細根的IAA、GA與ZT含量，并降低ABA含量。

2.2 IAA/ABA、GA/ABA和ZT/ABA

植物的生長發育不僅與激素含量有關，更重要的是激素之間的相互作用，尤其是生長促進激素與生長抑制激素之間的比例與平衡（鄒曉霞等，2018）。從圖2可知，隨著根序等級的增加，各處理的 IAA/ABA比值呈逐漸降低的變化趨勢，而GA/ABA和 ZT/ABA呈逐漸升高的趨勢。同 CK相比，10-2處理1~5級根的IAA/ABA、GA/ABA和ZT/ABA比值變化較小，6-2處理 1~5級根的IAA/ABA、GA/ABA和ZT/ABA比值顯著降低，而 8-2處理 1~5級根的 IAA/ABA、GA/ABA和ZT/ABA比值則明顯升高，其中8-2處理不同根序細根IAA/ABA比值的平均值較CK、6-2和10-2處理顯著高出 45.96%、141.85%和 46.09%。同時可見，各處理1~2級根的IAA/ABA比值最高，并顯著高于GA/ABA和ZT/ABA比值；而GA/ABA比值在 3~5級根達最高值，且與 IAA/ABA、ZT/ABA比值差異達顯著水平。由此可見，楊樹切口處細根的IAA/ABA、GA/ABA與ZT/ABA比值在不同根序之間表現出明顯的變化規律，其中斷根對其有顯著的作用效果。

2.3 氮代謝關鍵酶活性

圖2 斷根對楊樹切口處不同根序細根內源激素平衡的影響Fig. 2 Effect of root pruning on the balance of endogenous hormone in different orders of fine root in poplar incision

圖3 斷根對楊樹切口處不同根序細根氮代謝關鍵酶活性的影響Fig. 3 Effect of root pruning on key enzymes in nitrogen metabolism of different orders of fine root in poplar incision

由圖3可知，隨著根序的增加，楊樹切口處細根的NR、GS、GOGAT與GDH活性基本呈逐漸降低的變化趨勢。8-2處理 1~5級根的 NR、GS、GOGAT與GDH活性均為最高，并顯著高于其他處理，其中8-2處理細根NR活性的平均值相比CK、6-2與10-2處理分別提高16.05%、32.06%與16.72%，GS活性的平均值分別提高 25.35%、49.72%與23.36%；10-2處理1~5級根的NR、GS、GOGAT與GDH活性相比CK均無顯著性變化；6-2處理1~2級根的 NR、GOGAT和 GDH活性顯著低于CK，而 3~5級根與 CK差異不顯著，同時，6-2處理1~5級根的GS活性顯著低于CK。從圖3還可知，各處理1~5級根的GS/GDH比值波動范圍為 3.21~4.84，均大于 1。同 CK相比，6-2處理1~2級根的GS/GDH比值顯著升高，10-2處理變化較小，而 8-2處理則顯著降低。此外，不同處理3~5級根的GS/GDH比值未呈現出明顯的變化規律。以上分析可知，不同斷根措施對楊樹切口處不同根序細根氮代謝關鍵酶活性的作用效果存在顯著差異，其中 8-2處理能顯著增強切口處各序級細根的硝酸還原酶、谷氨酰胺脫氫酶、谷氨酸合成酶與谷氨酸脫氫酶活性。

2.4 材積生長率

從圖4可知，不同處理材積生長率的變化規律表現為：8-2>10-2≈CK>6-2，其中8-2處理的材積生長率為58.96%，顯著高于其他處理，較CK、6-2與 10-2處理分別顯著高出 40.65%、64.46%與40.08%；其次是10-2與CK處理，材積生長率分別為42.09%與41.92%，兩者之間無顯著性差異，但較6-2處理分別顯著提高17.41%和16.93%。數據分析表明，不同斷根強度對楊樹材積生長的影響具有明顯差異，其中8-2處理相比6-2、10-2處理具有更顯著的增產效應，這進一步驗證了斷根強度的選擇發揮了決定性作用。

圖4 斷根對楊樹材積生長率的影響Fig. 4 Effect of root pruning on volume growth rate of poplar

2.5 相關性分析

斷根對楊樹切口處細根內源激素、氮代謝關鍵酶與材積生長之間的相關關系（表 1）表明，材積生長率與 IAA、GA、ZT、IAA/ABA、GA/ABA、ZT/ABA呈極顯著正相關，與NR、GS、GOGAT、GDH呈顯著正相關，說明細根的生長促進型激素與生長抑制型激素是相互制約、相互平衡的，且它們之間的比例與平衡對楊樹材積的生長具有顯著的促進效應，同時，細根的氮代謝關鍵酶亦能對林木生長發揮明顯的調控作用。這進一步表明楊樹切口處不同根序細根的內源激素與氮代謝之間存在一定的內部聯系，并以系統的方式共同調控細根的生長與功能發揮，也驗證了細根內源激素之間的比例與平衡及氮代謝關鍵酶活性的增強有利于促進楊樹林木的生長。

3 討論

內源激素可作為信號分子在時間與空間上調控植物發育的一系列生理生化過程（聶愷宏等，2018）。樹體的大小受到激素的顯著控制，且與IAA、GA、CTK、ABA等激素有明顯的直接關系（Lan et al.，2018）。一般認為，IAA、GA與ZT屬于生長促進型激素，而 ABA屬于生長抑制型激素（李洪娜等，2015）。鄒曉霞等（2018）對花生（Arachis hypogaea）的研究認為，根系IAA、GA、ZT含量與根系形態特征存在顯著或極顯著的相關性。本試驗結果顯示，隨著根序的增加，各處理的IAA含量呈遞減的趨勢，而GA、ZT與ABA含量呈遞增趨勢。分析其原因可能與IAA大多集中在生長旺盛的部位有關，而GA、ZT與ABA雖然主要在根尖合成（Lan et al.，2018），但由于細根的代謝周轉較快且運輸能力較強，從而在高級根中產生了一定的集聚效應。大量研究認為（李洪娜等，2015；鄒曉霞等，2018；聶愷宏等，2018；Lan et al.，2018），內源激素對植物生長發育的調控不僅依賴于不同內源激素的含量，更重要的是依賴于內源激素之間的平衡，且是一個系統的調控過程。IAA/ABA、GA/ABA與ZT/ABA比值能反映植物的生長及休止狀況，比值低表明抑制型激素 ABA占據優勢，植物的生長勢較弱；比值高則表征促進型激素占優勢，可顯著促進植物的生長勢（He et al.，2017）。本研究中，隨根序等級的增加，不同處理的IAA/ABA比值呈現出遞減趨勢，而 GA/ABA、ZT/ABA比值呈現出遞增趨勢，這與IAA、GA和ZT含量的變化規律相一致。

表1 楊樹切口處細根的內源激素、氮代謝關鍵酶與材積生長的相關性分析Table 1 Correlation analysis of endogenous hormone and key enzyme in nitrogen metabolism of fine root in poplar incision, and volume growth of poplar

在斷根處理中，8-2處理1~5級根的IAA、GA、ZT含量及IAA/ABA、GA/ABA、ZT/ABA比值均顯著高于其他處理，可能是由于8-2處理能顯著增強切口處細根的吸收能力與運輸功能，促使根尖的活性增強，進而更利于刺激GA和ZT的產生，且對地上部的頂端組織亦有顯著的激發效應。這表明8-2處理更利于促進切口處不同根序細根的生長勢，也進一步說明8-2處理能通過改變IAA/ABA、GA/ABA與ZT/ABA的比值來調控切口處新根的生長發育。有研究認為（李洪娜等，2015），較高的內源IAA與ZT含量有助于不定根的分化，對根的生長有顯著的促進作用。同時發現，8-2處理 1~5級根的ABA含量為最低值，這可能是8-2處理細根的IAA/ABA、GA/ABA與ZT/ABA比值較高的主要機理之一；也表明該處理能有效增加生長促進型激素含量，并降低生長抑制型激素含量，進而有助于根系的生長。

此外，10-2處理1~5級根的內源激素含量和對應的比值較對照無顯著性變化，究其原因與 10-2處理的斷根距離樹干較遠，斷根強度較弱，致使斷根對切口處的刺激作用很有限有關（Jing et al.，2017）。而 6-2處理的 IAA、GA和 ZT含量及IAA/ABA、GA/ABA與ZT/ABA比值均為最低，其原因與 6-2處理的斷根對楊樹自身造成的傷害較大，使切口處的恢復明顯滯后（Du et al.，2012），導致萌發新根的數量較少有一定關聯；同時，6-2處理的 ABA含量最高亦是引起 IAA/ABA、GA/ABA與ZT/ABA比值較低的原因之一。

以上分析可知，切口處細根的萌發與生長發育以及功能的發揮實際上是促進生根的激素與抑制生根的激素之間相互制約、相互平衡的過程，即激素是以系統的方式來調控切口處細根的形態建成與功能（陳鴻鷹，2017）。

NR是植物氮同化過程中的關鍵酶，能生成NH4+與不同的含氮化合物；GS與GOGAT組成的循環是高等植物氨同化的一個重要途徑；而 GDH途徑是植物氨同化的重要支路之一，能在緩解或解除高氨對植物毒害方面發揮特有的生理效應（張紅敏等，2014）。本試驗中，隨根序的增加，各處理的 NR、GS、GOGAT活性呈現出遞減的趨勢，且1~2級根顯著高于3~5級根，這表明1~2級根有助于增強氮素的同化吸收能力，這與前人針對山定子（Malus baccata Borkh.）和平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）幼苗根系氮代謝酶的研究結果相類似（王英等，2010）。有研究發現（Gajewska et al.，2018），GS與GOGAT活性的同向變化可能與反應產物的正反饋調節有一定關聯，說明GOGAT活性變化可能是林木對其體內GS活性變化的一種適應機制。同時，不同處理1~2級根的GDH活性顯著高于3~5級根。GDH有利于TCA循環中間體氧化為α-酮戊二酸，進而調控林木體內銨同化吸收過程中的碳供應狀況（井大煒等，2016）。

各處理不同根序細根的GS/GDH比值均大于1，這說明在高等植物體內，雖然 GS/GOGAT與GDH兩條氮同化途徑同時存在，但楊樹切口處細根的氮代謝以GS/GOGAT途徑為主，斷根并未改變根系氮代謝途徑。分析可知，6-2處理1~2根的GS/GDH比值較對照明顯升高，而 8-2處理則顯著降低。說明6-2處理使GDH途徑在1~2級根氮代謝中的作用有所減弱，而8-2處理能增強GDH途徑在細根氮代謝中的作用。可見，6-2處理可能會減弱切口處細根解除氨中毒的能力，故易發生氨中毒現象，而8-2處理則相反。此外，8-2處理1~5級根的氮代謝關鍵酶活性均顯著高于其他處理，其原因可能與內源激素的調控有一定聯系；也可能與 8-2處理能有效調節氮素的供應強度有關，可能更接近于楊樹的需肥規律，進而更利于氮素的同化吸收。

許多因素會綜合影響楊樹的生長發育。與其他處理相比，8-2處理能明顯促進楊樹材積的生長，且對材積生長率的提高幅度最大。相關性分析可知，材積生長率與 IAA、GA、ZT、IAA/ABA、GA/ABA、ZT/ABA達極顯著相關關系，與 NR、GS、GOGAT、GDH達顯著相關關系，這表明內源激素之間的比例與平衡及氮代謝關鍵酶活性的增強有助于促進楊樹林木的生長。陳鴻鷹（2017）采用外源酚酸對歐美楊‘I-107’扦插苗的研究亦得出了相似的結果。也有報道表明（Gu et al.，2018），氮代謝關鍵酶活性與土壤的供肥能力密切相關，并直接影響根系的生長與再分配。由此可知，切口處不同根序細根的內源激素含量與平衡及氮代謝關鍵酶活性是促使楊樹增產的內在機理之一。

4 結論

8-2處理（8倍胸徑兩側）處理1~5級根的IAA、GA、ZT含量及 IAA/ABA、GA/ABA和 ZT/ABA比值均顯著高于對照、6-2（6倍胸徑兩側）和10-2（10倍胸徑兩側）處理，而ABA含量明顯低于其他處理。隨根序的升高，各處理細根的IAA含量和IAA/ABA比值逐漸降低，而GA、ZT、ABA含量和GA/ABA、ZT/ABA比值呈遞增趨勢。同時，不同處理細根的NR、GS、GOGAT和GDH活性隨根序的增加而呈遞減趨勢；8-2處理1~5級根的這4種酶活性均顯著高于其他處理，而 1~2級根的GS/GDH比值最低。此外，8-2處理的材積生長率最高，并與其他處理差異達顯著水平。

綜合分析認為，8倍胸徑兩側的斷根方式可通過調節各級細根的內源激素含量與平衡，以及增強氮代謝關鍵酶活性來提升切口處細根的活性，進而促進林木材積的增長。