丁酸梭菌及其飼用菌制劑的研究與開發

張吉

（1.湖北博大生物股份有限公司，湖北 黃石 435000；2.江西省農業科學院畜牧獸醫研究所，江西 南昌 330200）

丁酸梭菌（Clostridium butyricum），全名丁酸梭狀芽孢桿菌（Clostridium butyrate bacillus）， 又 名丁 酸菌（Butylic acid bacteria）、 酪酸菌（Butyric acid bacteria）、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）、 宮 入菌（Clostridium butyricum Miyairi）， 為芽孢桿菌科（Bacillaceae）、梭菌屬（Clostridium）[1]嚴格厭氧的革蘭氏陽性產芽孢短桿菌，菌體中常有圓形或卵圓（橢圓）形芽孢，偏心或次端生，可抵御不良環境，廣泛分布于人和動物的腸道、糞便，奶酪、酸奶、酒窖泥，以及土壤、樹葉等自然環境中[2]，細菌學分類屬于厚壁菌門（Firmicutes）、梭菌綱（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）、芽孢桿菌科（Bacillaceae）、梭菌屬（Clostridium）[3]。

1 丁酸梭菌的發現、發展簡史

1.1 丁酸梭菌在國外的發現、分離與產業化

丁酸梭菌之所以又名宮入菌，是因為丁酸梭菌最先由日本千葉醫科大學宮入近治博士首先于1933年發現并報道的[4]。俄羅斯微生物研究所的Kingi miyairi博士于1935年從健康人的糞便與土壤中分離出丁酸梭菌，并從丁酸梭菌厭氧培養的過濾物中發現含有乳酸、丁酸等短鏈脂肪酸[3]。這些短鏈脂肪酸具有較強的調理腸道功能，也就是整腸作用，即能夠調整腸道液體的分泌（抑制腸液的過量分泌，促進腸液的吸收），減少腸內的水分含量，也就相應地減少了大便中的水分，從而抑制腹瀉；同時還能夠促進腸道中如雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌的生長，抑制腸道中的致病菌的生長，維持腸道菌群平衡，提高機體免疫功能，增進動物健康，促進動物生長。日本于1944年成功研制出可用于臨床的丁酸梭菌制劑，該制劑克服了雙歧桿菌、乳酸菌等益生菌制劑室溫存活率與胃酸中通過率低、不產丁酸、治療效果慢的缺點，能夠廣泛應用于諸如急、慢性腸炎引起的腹瀉、非潰瘍性消化不良、腸易激綜合癥以及各種原因（腸道感染、外科手術等）所致的腸道菌群紊亂等腸道疾病的治療，且療效穩定，有效率達90%以上，尤其是對使用抗生素后所致的偽膜性腸炎有著獨特的效果，很快成為該領域的國際壟斷產品[3,5-6]。從此，丁酸梭菌制劑在日本開始作為調理人體胃腸功能的整腸藥一直使用至今。

1.2 我國對丁酸梭菌的引進、自主創新與產業化

我國的黑龍江省科學院微生物研究所，于1992年自俄羅斯微生物研究所引進丁酸梭菌，并在中國定植。我國自1993年起，自日本進口丁酸梭菌制劑，先后在上海、廣州、哈爾濱等十幾家著名醫院用于治療腸道菌群紊亂引起的腸炎、腹瀉、消化不良等疾患，療效顯著。我國從1996年開始研制能替代抗生素治療頑固性腸炎、腹瀉，預防腸病并發癥及腸癌的微生態生物藥物，并列入國家863重點攻關項目，項目主持人為留學歸國人員、著名醫學微生態專家崔云龍博士。崔云龍博士及其領導的團隊，歷經2年多的時間，自偏遠山嶺、荒野采集的2萬份樣品中篩選出50多個新菌種，幾經比較，最后篩選出丁酸梭菌CGMCC313-1菌株。這是我國第一株治療腹瀉、腸炎、阻止腸惡變的藥用丁酸梭菌菌株。經過中國藥品生物制品檢定所反復檢驗，論證其綜合性狀遠超國際同類菌種。隨后，又經3年多的研究、歷經2萬多次試驗，逐一攻克了丁酸梭菌的高產量發酵技術、低溫分離技術、制劑技術以及常溫保存技術等關鍵技術。他們運用自主研發的發酵工藝，丁酸梭菌的產量每毫升含菌量達到1億個、芽孢比例達到95%，這是目前可查到的國際專利數據的100倍，臨床研究結果也證實其療效超過同類的日本產品。2003年10月開始該項成果的產業化，2004年試產成功，并成功實現了產業化生產，拓開了市場，從而徹底打破了日本半個多世紀以來對該技術的壟斷。目前，丁酸梭菌已普遍應用于人的腸道疾病。特別值得指出的是，崔云龍團隊成功發明的常溫條件下長期保存丁酸梭菌活性技術，標志著我國成為當今世界上在微生態生物制劑領域里掌握著該核心技術的唯一國家。與此同時，崔云龍團隊還成功研制出其他能夠治療腸道菌群失調、恢復腸道健康，具有一定活性的微生態制劑。例如，藥用凝結芽孢桿菌TBC-169菌株。這是一株藥用價值很高的優秀菌株，能選擇性促進腸道雙歧桿菌等益生菌的生長繁殖，并分泌抗菌凝固素，對7種腸道致病菌的生長繁殖有較強的頡頏與抑制作用。我國因此成為世界上第二個具備該制劑生產技術的國家。

1.3 丁酸梭菌作為飼料添加劑在我國的開發與應用

1.3.1 丁酸梭菌被批準用作畜禽飼料添加劑

我國原農業部于2006年將丁酸的鈉鹽- 丁酸鈉（Sodium Butyrate）列入《飼料添加劑品種目錄》。丁酸鈉產品應用于動物飼料中，主要是發揮其胃腸道微生態調節劑、腸黏膜營養劑、電解質平衡調節劑、復合酸化劑、誘食劑以及香味劑等作用。2009年7月，我國原農業部正式批準丁酸梭菌制劑作為新飼料添加劑，可在包括養豬業在內的畜牧生產上使用[7]，這極大地推動了丁酸梭菌作為飼料添加劑在我國的研究與應用。

1.3.2 我國成功研制出可作為飼料添加劑的丁酸梭菌

我國研究者對丁酸梭菌的研究主要是在人的醫學臨床應用上，但作為飼料添加劑的應用研究，也就是近幾年的事。

趙建新等于2002年，自健康人的糞中分離到4株丁酸梭菌并對其進行安全性評價，發現其中的丁酸梭狀芽孢桿菌Z-10菌株可用作生產飼用益生菌[8]。浙江惠嘉生物科技有限公司最先研制出可用作飼料添加劑的丁酸梭菌，并于2009 年11月，獲得了原農業部頒發的全國首個益生菌方面的飼料添加劑新產品證書，同時獲得新產品證書的還有該公司生產的地衣芽孢桿菌。此后，浙江惠嘉在這兩個產品基礎上，相繼增加了多種芽孢桿菌、乳酸菌和微生物代謝產物，形成了一個系列的益生菌制劑產品，在全國乃至世界范圍推廣[9]。2016年3月，江蘇三儀生物產業集團制定的丁酸梭菌及新型復合酶制劑企業質量標準通過驗收，這為三儀集團申報以丁酸梭菌為主的單一型與混合型飼料添加劑以及酶制劑的生產資質奠定了基礎[10]。

近年來，我國的有關大專院校、科研院所以及企業加大了丁酸梭菌作為飼料添加劑的研發，成果已在動物養殖領域應用。然而，就整體而言，將丁酸梭菌成功地商業化用作畜禽水產飼料添加劑，目前還多是韓國、日本等少數幾個廠家生產的丁酸梭菌制劑。

2 丁酸梭菌的生物學特性

2.1 丁酸梭菌是一個集芽孢桿菌與乳酸菌優點于一身的天然綠色菌種

丁酸梭菌既能像芽孢桿菌那樣具有諸如耐熱（常溫下易保存）、耐胃酸、耐膽鹽等抗逆性，又能像乳酸菌那樣在腸道厭氧環境下生長、并產生乳酸，特別是還能產生丁酸；既克服了芽孢桿菌在腸道這樣的厭氧環境下，不能很好地生長、且不產乳酸的缺點，又克服了乳酸菌耐熱性差，室溫存活率低，在常溫下不易保存、65～75 ℃下即死亡，在生產乳酸菌制劑過程中死亡率高，不適于在制粒飼料中添加，胃酸通過率低，且不能產生丁酸的缺點；所以，丁酸梭菌是一個集芽孢桿菌與乳酸菌優點于一身的極具潛力的飼用益生菌。丁酸梭菌無毒副作用，不存在毒力返強的風險，既可用作飼用益生菌種，又可用作治療藥物；既像食品一樣安全，又像藥品一樣有效（針對慢性腹瀉、腸炎等腸道疾病）；打破了 是藥三分毒 的傳統觀念，是真正安全的天然綠色菌種。丁酸梭菌制劑是剛剛起步且極具潛力的飼用益生菌制劑[11]。

2.2 丁酸梭菌的抗逆性強

丁酸梭菌由于能夠生成芽孢，因而具有耐熱、耐酸、耐鹽、易保存的生理特征。特別丁酸梭菌所生成的芽孢為內生芽孢，使得其具有較強的抗逆性，表現在：1）耐熱。丁酸梭菌制劑經80 ℃、30 min和90 ℃、10 min熱處理后的存活率為98%；經90 ℃、20 min熱處理后的存活率為95%；經100 ℃、5 min熱處理后的存活率仍高達80%。因此，丁酸梭菌足以耐受飼料制粒過程中的高溫、高熱工藝；2）耐酸。丁酸梭菌在pH為1.0～5.0時仍能存活，同時丁酸梭菌對pH的適應范圍較廣，在pH為4.0～9.8時仍能適合其生長；3）耐酸、耐鹽、耐膽汁。無論是動物胃腸道環境還是人工胃液、腸液和膽鹽，丁酸梭菌都具有良好的耐受性，能在其中存活，進入動物腸道后亦能夠存活生長；4）耐干燥。丁酸梭菌的固體活菌制劑，在干燥、室溫環境下保存3年以上，活菌數未見減少[12]。飼用丁酸梭菌制劑中的活菌是以芽孢形式存在的，因而能夠適應腸道的產酸、產膽汁鹽的厭氧環境，發揮調節菌群平衡的功能，并能夠順利地通過飼料生產（含制粒）加工，這樣就基本滿足了綠色益生菌制劑產業化的全部需求。

2.3 丁酸梭菌在動物腸道內的五大生物學特性

丁酸梭菌作為飼用益生菌種，在動物腸道內呈現出五大生物特性：1）丁酸梭菌作為厭氧芽孢桿菌，不受胃酸、膽汁酸等影響；2）丁酸梭菌產生的丁酸、乳酸，能夠促進動物腸道中乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌群的增殖與發育，抑制腸道內有害菌和腐敗菌的生長、繁殖，糾正腸道菌群紊亂，調節腸道微生態平衡，減少腸毒素的產生；3）丁酸梭菌在動物腸道內產生的淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶等消化酶以及B 族維生素、維生素K等維生素，這些物質連同丁酸等對動物具有營養保健作用[13]；4）丁酸、乙酸、氫氣等丁酸梭菌的代謝產物，能夠減輕腸道炎癥，加速腸道損傷修復，尤其是主要代謝產物丁酸，它是腸道上皮組織細胞再生和修復的主要營養物質[14-15]；5）對多種飼用抗生素具有較強的耐受性，可以與之配伍使用。由此可見，丁酸梭菌作為飼用益生菌，集芽孢桿菌與乳酸菌的優點于一身，既具有優良的生產性能，又具有耐熱、易貯藏、適應動物腸道微生態環境（厭氧、酸、膽鹽）的特性，對于減少當前動物生產中飼用抗生素的濫用、減少藥物在肉、蛋、乳等畜禽產品中的殘留、降低動物細菌的耐藥性與保障動物健康方面有著重要的意義，是一個極具潛力的飼用益生菌種，有著廣闊的市場前景。

3 丁酸梭菌的組合應用

3.1 丁酸梭菌與益生菌的組合應用

不同的益生菌制劑，有著不同的作用機制與途徑，解決的問題也不盡相同。僅憑某個單一的益生菌制劑，通常很難完全滿足養殖動物的生理要求。根據具體的養殖品種，將相互促進發揮協同作用，而不是相互頡頏產生抑制作用的幾種益生菌在正組合效應基礎上，按照一定比例配伍制成協同共生、優勢互補的復合益生菌制劑，就能發揮出比單一菌制劑更顯著的應用效果，共同完成對動物的營養調控作用。丁酸梭菌作為飼用益生菌，既可單獨添加，也可與一些益生菌配伍使用，以發揮益生菌群間互作的正組合效應。例如，將丁酸梭菌與地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌進行集成，組合成一個具有多種功能的綠色 三酵菌 制劑，能較好地解決動物的腸道健康問題，從而在動物生產中少用或者不用抗生素。鑒于腸球菌易產生耐藥性、移位及室內感染，世界衛生組織建議在復合益生菌制劑中不應含有腸球菌，我國目前雖然還沒有這方面的明確規定，在選擇與丁酸梭菌配伍的益生菌時，還是應盡量避免選用腸球菌[7]。目前，在養豬生產中常見的與丁酸梭菌配伍的幾個菌種組合，如應用于斷奶仔豬的丁酸梭菌與戊糖片球菌、植物乳桿菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌配伍組成的復合菌劑。

3.2 丁酸梭菌與其他營養活性物質的配伍使用

丁酸梭菌或其復合益生菌制劑與：1)益生元、酶制劑、中草藥制劑等的配伍；2)酸化劑、益生素、中草藥提取物等的配伍；3)復合酶制劑（包括蛋白酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、木聚糖酶與單寧酶）的配伍；4)酵母細胞壁和核苷酸的配伍；5)低聚木糖等的配伍。

3.3 丁酸梭菌與抗生素的組合應用

1)由于丁酸梭菌對鏈霉素、紅霉素、強力霉素、氨芐青霉素、潔霉素、羥氨芐青霉素、沙交霉素、磺胺甲硝唑、頭孢立新、阿米卡星、環丙沙星、多黏菌素E等多種抗生素，尤其是吡哌酸與氨基糖苷類抗生素具有抗性，對這些抗生素不敏感，故丁酸梭菌作為獸藥在與這些抗生素聯合使用時，其生物功能不僅不受影響，還能加強抗生素的治療效果，減少抗生素的用量，避免長期大量應用抗生素給動物及人類的健康帶來危害；2)丁酸梭菌的這種對多種抗生素的抗性，對其在目前普遍添加有抗生素的飼料中，而養殖場又濫用抗生素的情況下，仍能發揮其功效有著特殊意義；3)丁酸梭菌并不是對所有抗生素都有抗性或不敏感，丁酸梭菌與抗生素組合應用時，不能與氯霉素、先鋒霉素、新生霉素、萬古霉素、林可霉素、替硝唑、甲硝唑、氨芐西林、四環素等組合使用，因為丁酸梭菌對這些抗生素不具抗性[11]。

4 導致飼用丁酸梭菌等益生菌制劑效果不穩定的因素

上面闡述的丁酸梭菌的諸多優點，是在嚴格控制試驗條件下所得到的研究結果，與商業大規模生產的條件相比，還存著較大差距。這就是動物飼料中添加飼用丁酸梭菌等益生菌制劑，有時效果不明顯，甚至完全沒有效果的原因，這不完全是丁酸梭菌等益生菌制劑自身的問題，下列情況下即使使用品質好的益生菌制劑，也不一定能表現出好的效果：1)丁酸梭菌等益生菌制劑在動物生產中的應用，重在維持腸道健康、防病與促生長，不在治病，療效不如抗生素那樣迅速很正常；2)一些飼料其營養水平配制已較高，添加丁酸梭菌等益生菌制劑的效果就不一定顯著。而在營養水平較低的日糧中添加丁酸梭菌等益生菌制劑，其效果就比在營養水平較高的日糧中添加顯著。較高的營養水平配制，典型的例子有：①日糧已添加酸化劑、植物提取物、植物精油、寡糖等任何一種添加劑的飼料或其組合物；②已添加功能脂肪（ω-3多不飽和脂肪，具抗氧化、抗應激功能）、動能脂肪（中鏈脂肪特別是OPO（1，3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯）脂肪，能夠為哺乳仔豬快速補充能量，快速恢復體能）的哺乳仔豬日糧；③添加有優質桑葉粉（粗蛋白高于28%）的斷奶仔豬日糧，因為桑葉亦具有抑制腸道金黃色葡萄菌、大腸桿菌等致病菌，促進腸道乳酸菌、雙岐桿菌等益菌生長的功能，從而通過調節腸道菌群數量維持動物腸道菌群平衡的功能；3)菌株宿主源性造成的差異，即來源于豬腸道分離的菌株，其對豬的效果明顯而對雞則未必有效，所以不同來源的丁酸梭菌菌株及其復合菌制劑以及其他益生菌制劑，應根據其菌株來源而選擇最適合的使用對象；4）動物在不同生長期，其對益生菌的需求不同。初生動物由于腸道菌群尚未建立或處于不穩定狀態，此時飼喂丁酸梭菌等益生菌要比后期腸道已建立起相對穩定的菌群后使用益生菌的效果明顯；5）就哺乳動物而言，因斷奶前后日糧的差異，造成腸道中營養物質的差異，結果導致所需的益生菌群差異，這就要求差異性地供給動物適用的益生菌（含與丁酸梭菌配伍的不同專用菌）；6）環境條件較差時，給生產動物飼喂丁酸梭菌等益生菌的效果要顯著得多，這是因為所飼喂動物的腸道內的菌群組成缺乏有益菌或腸道內存在著反作用菌（即抑制生長的菌）時，飼喂丁酸梭菌等益生菌的效果更明顯；而當動物自然接種了大量有益菌或其腸道內不存在反作用菌時，飼喂丁酸梭菌等益生菌的效果則不明顯；7）盡管丁酸梭菌對大部分抗生素具有抗性，但并不是對所有的抗生素均有抗性，特別是：一方面，配合飼料中添加的亞治療量抗生素，遠超丁酸梭菌的耐受性劑量；另一方面，與丁酸梭菌配伍的其他益生菌對抗生素敏感，因此在添加飼用丁酸梭菌等益生菌制劑時，還是要注意飼料中所添加的抗生素的品種及其含量；8）由于丁酸梭菌等益生菌菌株間存在著血清型的周期性變異，滯留在腸道中的菌株能否繼續存在，還取決于其競爭性爭奪腸黏膜結合位點的能力。因此，丁酸梭菌等益生菌應持續在飼料中添加使用。

5 存在問題與展望

當前，開發利用丁酸梭菌所存在的問題及其改進方法：1）丁酸梭菌是極其嚴格的厭氧菌，發酵生產的得菌率低，限制了它的廣泛應用。特別是由于不同生產廠家的菌株來源及發酵水平的差異，導致市場產品質量參差不齊，使用效果貶褒不一。今后除須進一步加強丁酸梭菌生產工藝的研究外，還要優化出更適合丁酸梭菌生長的培養基；2）目前，對于丁酸梭菌及其代謝產物在動物體內的代謝過程、作用機制尚未徹底明了，只有全面、深入地掌握了其具體的作用機理，才能更好地發揮丁酸梭菌的作用；3）丁酸梭菌與其他益生菌配伍的組合效應及其機理有待進一步深入研究；4）丁酸梭菌在不同動物及同一種動物不同階段、生理狀態的適宜添加量研究；5）利用基因工程技術，對現有丁酸梭菌進行改造，以期獲得更加優良的菌種。例如，鑒于丁酸梭菌是一種適合于木質纖維素同步糖化發酵生產丁酸的菌種，可以利用阿拉伯糖、葡萄糖、纖維二糖、木糖等多種底物進行發酵產酸（主要發酵產物為丁酸和乙酸）。將丁酸梭菌乙酸發酵關鍵基因取代為丁酸發酵關鍵基因來構建突變株，可增加突變株的丁酸發酵產量，減少乙酸的發酵量。Niall等[16]分別將來源于丙酮丁醇梭菌的丁酸代謝關鍵酶基因- 乙酰乙酰輔酶A轉移酶基因(thl)、來源于丁酸梭菌本身的乙酸代謝關鍵酶基因片段- 磷酸轉乙酰基酶基因片段(pta)和來源于質粒pIMP1的紅霉素抗性基因(em)。將它們與質粒pUC19相連構建為非復制性質粒pUC19-EPT。通過電轉化將其導入丁酸梭菌中。再利用紅霉素抗性平板篩選獲得轉化子，通過PCR驗證發現：獲得的突變株染色體上pta被thl替換。在以葡萄糖為底物的發酵中，突變株丁酸得率為0.47，較野生型增長了34%，乙酸得率為0.05，較野生型下降了29%。這為新型丁酸梭菌基因工程菌的構建提供了借鑒。