超高效液相色譜串聯質譜法同時檢測蜂蜜中多種抗生素殘留的研究

徐宜宏，李曉東，姜玲玲，張 彤，鐘 鈺

（中華人民共和國沈陽海關，遼寧 沈陽 110016）

蜂蜜中含有豐富的果糖和葡萄糖，是大腦神經元所需要的主要能量元素，它能很快被人體吸收利用，不僅能夠改善人體的血液循環、補充營養、緩解和恢復人體疲勞，還能起到潤肺止咳、消積通便等作用[1-2]，因此，隨著人們生活水平逐漸提高，蜂蜜的消費需求正在逐年增大。然而，在蜜蜂養殖過程中，蜂群極易感染美洲幼蟲腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病、麻痹病等疾病，不可避免地會使用到喹諾酮類、四環素類、磺胺類等抗生素，導致蜂蜜中抗生素殘留問題嚴重，消費者通過食用蜂蜜，間接將這些抗生素攝入到身體中，從而導致體內抗生素大量殘留，影響身體健康，因此，建立一種能夠快速、準確測定蜂蜜中多種藥物殘留的方法勢在必行。

目前抗生素殘留檢測的方法主要有加速溶劑萃取法[3]、液相色譜法[4-5]、液相色譜串聯質譜法[6-9]等，該文根據國內外限量要求，建立了蜂蜜中四環素類、大環內酯類、磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類等5類24種常用獸藥基于QuEChERS[10-12]技術提取凈化的超高效液相色譜串聯質譜的定性和定量方法。經實驗證明該方法準確、靈敏度高、重現性好，能夠滿足同時檢測蜂蜜中多種抗生素殘留的需要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑：甲醇、乙腈均為色譜純；甲酸、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、氯化鈉、醋酸鈉均為分析純；C18吸附劑購于天津Bonna-Agela公司。

1.1.2 儀器設備：Acquity UPLC/QTRAP 5500液相色譜串聯質譜儀，沃特世公司/AB SCIEX公司；X1R低溫離心機，Thermo公司；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器，Scientific Industries公司；BSA822電子天平，Sartorius公司；CPA225D電子天平，Sartorius公司；N-EVAP111氮吹儀，Organomation Associates公司；Milli-Q Gradient超純水機，Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理：稱取2.0 g樣品于50 mL塑料離心管內，加入10 mL含1.0%（V/V）甲酸的乙腈溶液和0.1 g Na2EDTA，振蕩1 min；再加入4.0 g無水硫酸鈉和1.0 g氯化鈉，渦旋混勻15 s，超聲15 min，9 000 r/min離心5 min；將6 mL上清液加入900 mg無水硫酸鈉，150 mg C18吸附劑，水平振蕩5 min，使吸附劑和提取液充分接觸；以9 000 r/min離心5 min，靜置10 min沉淀蛋白后，取3 mL上清液于10 mL試管中，40℃下氮氣濃縮至干。加入1 mL 0.1%甲酸—乙腈（9∶1）的定容液，渦旋混勻后，過0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜串聯質譜法（UPLC-MS／MS）測定。

1.2.2 色譜與質譜條件的選擇

1.2.2.1 液相色譜條件的選擇：色譜柱為AC-QUITY UPLCTMBEH C18（100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm）；柱溫：40℃；樣品室溫度：室溫；進樣體積：10 μL；流速：0.2 mL/min；流動相 A：甲醇；流動相 B：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫條件見表1。

表1 24種抗生素梯度洗脫條件

1.2.2.2 質譜條件的選擇：選擇ESI+為檢測離子源，離子源溫度為550℃；離子噴霧電壓及入口電壓分別為5 500 V和10 V；霧化氣壓力、輔助加熱氣壓力、 氣簾氣壓力分別為345、345、207 kPa；用MRM掃描模式。

2 結果與討論

2.1 提取液的選擇優化

傳統QuEChERS方法常用的提取液為乙腈，但考慮到蜂產品中含有大量的糖分、水分、酶類，同時查閱文獻分析，設計乙腈、1.0%（V/V）甲酸—乙腈溶液、Na2EDTA的酸性乙腈（含1%甲酸3種提取液進行實驗比較。每類待測物選取1～2個代表性藥物測定回收率，結果見表2和圖1。

由結果可知，僅使用乙腈為提取溶劑時，四環素類抗生素的回收率較低，這可能與該類物質易與蜂蜜中鈣、鎂、鈉等礦物質離子螯合形成難溶的鹽類有關。使用加入Na2EDTA的酸性乙腈（含1%甲酸）作為提取液時，抑制此類化合物與陽離子的螯合，回收率較高，因此，初步選用Na2EDTA的酸性乙腈（含1%甲酸）作為提取液。

表2 提取溶劑種類對回收率的影響 %

圖1 提取溶劑種類對回收率的影響

2.2 質譜條件的優化

經過反復試驗，得出24種抗生素的最優質譜條件。各抗生素的檢測離子見表3。多反應監測色譜圖見圖2。

3 方法學驗證

3.1 回收率及精密度

在空白蜂蜜中添加不同含量水平的多種抗生素混標，制成模擬加標樣品，按上述試驗方法操作，同時做空白對照。所得到的樣品中各待測抗生素的添加回收率和相對標準偏差見表4。

試驗結果表明，在所考察的蜂蜜中，24種抗生素的回收率在68.0%～104.0%，相對標準偏差為3.2%～15.5%，待測抗生素都能得到較理想的回收率，該方法符合檢測方法對精密度的要求。

3.2 線性關系和檢出限

用空白樣品溶液稀釋混合標準儲備溶液，制備成不同濃度的混合標準工作溶液，在選定色譜和質譜條件下，用混合標準工作溶液分別進樣，以峰面積（y）為縱坐標，以工作溶液的濃度為橫坐標，繪制6點標準工作曲線。標準工作曲線、線性回歸方程及相關系數r見表5。向空白樣品中添加不同質量的標準溶液，按上述方法進行測定，24種抗生素的檢出限均可達到1 μg/kg。

4 結論

該文對應用超高效液相色譜串聯質譜法同時檢測蜂蜜中喹諾酮類、磺胺類、大環內酯類等多種抗生素殘留進行了系統研究，以1%甲酸乙腈—Na2EDTA溶液為提取液，液相色譜串聯質譜儀同時對蜂蜜中多種抗生素進行檢測。該方法具有操作簡單、試劑使用量小、檢測周期短等特點，且最低檢測限完全滿足目前的市場要求，可在實際檢測樣品時節約大量人力、物力及時間成本。

表3 待測獸藥的質譜參數

圖2 24種抗生素混合標準溶液的TIC圖（橫坐標：保留時間；縱坐標：峰高）

表4 蜂蜜中各待測抗生素不同添加水平下的回收率和相對標準偏差（n=6）

表5 抗生素的線性回歸方程、相關系數、檢出限