苦參素對肝纖維化大鼠肝臟轉(zhuǎn)化生長因子-β1的調(diào)節(jié)作用

金學琴，黎偉華，李志梅，何生存，潘 琳

（1.寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學藥學院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004；4.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院檢驗科，寧夏 銀川 750004）

苦參素（oxymatrine，OMT）又名氧化苦參堿，是一種喹嗪類生物堿，從傳統(tǒng)中藥廣豆根中提取所得[1]，其藥理作用包括調(diào)節(jié)免疫反應、抗炎癥、抗過敏反應和抑制組胺釋放[2]。OMT（C15H24N2O2）作為有效的單體生物堿臨床已用于治療慢性病毒性肝炎[3-4]，它能夠顯著降低體內(nèi)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的水平，對臨床癥狀有所改善。有文獻報道其通過激活Nrf2/HO-1和調(diào)節(jié)炎性TLR4信號通路對肝衰竭起到保護作用[5]，但其具體作用機制尚未明確。該試驗通過探討 OMT 對轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）通路的影響，進一步了解OMT抗肝纖維化的作用機制，為臨床治療肝纖維化用藥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物：60只雄性SD大鼠（SPF級），體重 （250±50）g，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK（寧）2015-0001]提供，并飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心屏障內(nèi)[SCXK （寧）2015-0001]，室溫、晝夜（12 h/12 h）明暗交替飼養(yǎng)，自由進水攝食。 每只動物僅用于一個單一的試驗并按動物實驗“3R”原則給予人道關懷。

1.1.2 主要試劑與設備：氧化苦參堿（OMT）由中國食品藥品檢定研究院提供，在使用前用生理鹽水配制成所需濃度；水飛薊素膠囊由德國馬博士大藥廠提供；硫代乙酰胺 （TAA）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）各試劑盒由中國南京建成試劑公司提供；TGF-β1檢測試劑盒由中國上海森雄科技實業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組與處理：將60只SD大鼠隨機平均分為6組，分別為陰性對照組、模型組和OMT高、中、低劑量給藥組以及水飛薊素陽性對照組。使用硫代乙酰胺（200 mg/kg）對OMT高、中、低劑量給藥組和模型組、水飛薊素陽性對照組大鼠進行腹腔注射，每周3次，連續(xù)2周；第3周開始每周2次，連續(xù)6周；第9周開始每周1次，連續(xù)4周。在造模的第2周開始至造模結(jié)束，對陰性對照組及模型組大鼠給予生理鹽水灌胃；對OMT高、中、低劑量給藥組大鼠分別給予苦參素（80、40、20 mg/kg）灌胃；對水飛薊素陽性對照組大鼠給予水飛薊素（30 mg/kg）灌胃，每天1次。至第12周末，處死大鼠并采血留取血清，迅速取其肝組織超低溫保存。

1.2.2 血清中ALT、AST和GSH指標的測定：將大鼠麻醉后取血，將取得血液室溫靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，分離上層血清。按試劑盒操作說明書采用酶標法檢測血清中ALT、AST和GSH的含量。

1.2.3 肝組織勻漿中TGF-β1含量的測定：按試劑盒操作說明書采用酶標法測定肝組織勻漿中TGF-β1含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和t檢驗，計量數(shù)據(jù)以±S表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 OMT對硫代乙酰胺誘導的肝纖維化模型大鼠血清中ALT、AST和GSH的影響

與陰性對照組相比，模型組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST含量極顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，OMT高、中、低劑量給藥組及水飛薊素陽性對照組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST含量均顯著（P<0.05）降低。與陰性對照組相比，模型組大鼠血清GSH含量極顯著（P<0.01）下降。與模型組相比，水飛薊素陽性對照組大鼠肝組織GSH表達量顯著上調(diào) （P<0.05）；OMT高劑量和中劑量給藥組GSH含量極顯著（P<0.01）升高，而低劑量給藥組GSH含量顯著（P<0.05）升高，結(jié)果見表1。

表1 OMT對肝纖維化大鼠血清ALT、AST和GSH的影響

表2 OMT對肝纖維化大鼠肝組織勻漿中TGF-β1含量的影響

2.2 OMT對硫代乙酰胺誘導的肝纖維化模型大鼠肝組織勻漿中TGF-β1含量的影響

陰性對照組大鼠肝組織TGF-β1表達量很少。與陰性對照組相比，模型組大鼠肝組織TGF-β1含量極顯著（P<0.01）升高。與模型組相比，OMT高、中、低劑量給藥組大鼠肝組織中TGF-β1含量顯著（P<0.05）下降（見表 2）。

3 討論

慢性肝病進展成肝硬化必須要經(jīng)歷肝纖維化階段，它是影響慢性肝病預后的重要環(huán)節(jié)[6-7]。研究肝損害和肝纖維化最常用的模型是用硫代乙酰胺誘導大鼠肝損傷。其機制為硫代乙酰胺能造成大鼠肝細胞膜的脂質(zhì)破壞和蛋白變性，細胞膜受損，細胞內(nèi)酶外漏，血清ALT和AST活性增高[8]。 ALT、AST 含量越高，提示肝纖維化及肝硬化的程度越重。Saleh等[9]研究結(jié)果表明，二氫吲哚衍生物能夠顯著降低急性小鼠肝損傷模型中小鼠血清ALT和AST含量。該研究中，與陰性對照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST水平極顯著升高，表明模型組大鼠肝損傷形成。與模型組比較，OMT高、中、低劑量給藥組大鼠血清ALT和AST含量顯著降低，表明OMT高、中、低劑量給藥組能減輕肝損傷，改善肝臟功能，延緩肝纖維化的形成。

GSH為抗氧化系統(tǒng)成員之一，是一種自由基清除劑，可以屏蔽各種過氧化物的毒性作用，在氧化應激期間，GSH 的水平受到影響[10]，因此，GSH作為肝損傷的檢測補充指標，其活性也可以特異性地代表肝損傷情況。Younis[11]等報告了CCl4誘導的肝組織損傷大鼠血清ALT、AST含量顯著升高，GSH 含量顯著降低。Wang 等[12]研究表明，沒食子酰基金絲桃酐可顯著升高氧化應激誘導的肝損傷大鼠血清GSH含量。該研究中，OMT高、中、低劑量給藥組能夠顯著升高被降低的肝纖維化大鼠血清GSH含量，并呈劑量依賴性。硫代乙酰胺（TAA）誘導的大鼠肝纖維化模型中，肝細胞在清除產(chǎn)生的毒性自由基時消耗了較多的GSH[10]。模型組大鼠血清GSH含量顯著降低。當給予不同劑量苦參素干預時，大鼠血清GSH含量顯著上升，并呈劑量依賴性。這是因為，苦參素對肝損傷有保護作用，可以延緩肝纖維化，給予20 mg/kg OMT時毒性自由基減少，肝臟中的GSH消耗的量減少，從而使GSH的含量升高。而隨著OMT劑量增加到40～80 mg/kg時，GSH含量的升高遠遠超過了陰性對照組，該現(xiàn)象可能與OMT劑量過高引起的毒性反應有關[13]。該試驗在給予40 mg/kg和80 mg/kg劑量苦參素所測得的GSH含量高于陰性對照組，出現(xiàn)該現(xiàn)象的具體原因還有待于深入研究。

TGF-β1表達的差異參與了肝纖維化從發(fā)生到發(fā)展整個過程[14-15]，說明體內(nèi)肝纖維化程度與肝組織中TGF-β1表達的高低有密切關系。張英博等[8]研究表明，在CCl4誘導的小鼠肝纖維化中，肝臟TGF-β1水平顯著增加，給予補陽還五湯治療40 d后的小鼠肝組織中TGF-β1水平顯著下降。李秧秧等[16]研究結(jié)果表明，糖尿病大鼠非酒精性脂肪型肝病纖維化模型中，與陰性對照組相比，模型組TGF-β1水平顯著增加，當給予棉酚治療4～8周后，大鼠肝臟組織中TGF-β1水平顯著下降，病理檢查肝纖維化程度明顯減輕。在該試驗中，陰性對照組大鼠肝組織表達TGF-β1的量極少，模型組大鼠肝組織TGF-β1的含量明顯高于陰性對照組（P<0.01），OMT高、中、低劑量給藥組大鼠肝組織中TGF-β1的表達被顯著下調(diào) （P<0.05）。TGF-β1對肝纖維化的調(diào)節(jié)作用可能是通過細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮作用的，其與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關，是肝纖維化發(fā)生的主要信號傳導途徑[8，16-18]。

該研究表明，OMT可明顯降低肝纖維化模型大鼠肝臟組織中TGF-β1的基因表達，這個結(jié)果提示OMT抑制肝纖維化的機制之一可能是對TGF-β1表達的抑制。而苦參素對肝纖維化大鼠中TGF-β1下游因子如smads家族蛋白的調(diào)節(jié)作用，以及苦參素對肝纖維化大鼠細胞內(nèi)有關肝纖維化信號通路的影響，有待于進一步的研究。