嶗山奶山羊脂肪間充質干細胞系的建立及鑒定

劉宗正 ，肖 娜 ，楊培培 ，劉開東 ，李培培 ，王建華

（1.青島市畜牧獸醫研究所，山東 青島 266100；2.青島奧特種羊場，山東 青島 266100；3.青島派森諾基因科技有限公司，山東 青島 266100）

脂肪間充質干細胞是一類存在于動物脂肪組織中的成體干細胞。近年來，其被廣泛地應用于組織修復和基因治療等領域[1-3]。目前，研究人員已從多種動物體內分離得到了脂肪間充質干細胞，但對于嶗山奶山羊脂肪間充質干細胞的研究很少[4]。為此，筆者對嶗山奶山羊脂肪間充質干細胞進行分離培養和誘導分化，以期為嶗山奶山羊種質資源的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 組織樣品：脂肪組織取自1歲雄性育成嶗山奶山羊的腎臟周圍組織，嶗山奶山羊由青島奧特種羊場提供。

1.1.2 主要試劑：胎牛血清、牛血清白蛋白（BSA），購自SIGMA公司；青霉素、鏈霉素，購自華北制藥廠；Ⅰ型膠原酶，購自GIBCO公司；DMEM/F12（1∶1），購自 HYCLONE 公司；DMSO，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Transzol up、反轉錄試劑盒、EASY Taq MIX、pEASY-T1 Cloning Kit等分子生物學試劑均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.3 全能性相關基因引物序列及合成：根據NCBI GenBank中已公布的牛、羊和豬Oct-4、Sox-2、Nanog的mRNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件進行相似性比較，選取保守區序列，根據跨內含子原則進行引物設計，引物名稱、序列及基因登錄號見表1。引物由青島派森諾基因生物技術有限公司合成。

表1 嶗山奶山羊熒光定量RT-PCR引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1 嶗山奶山羊脂肪干細胞（ADSCs）的分離與培養：選取成年嶗山奶山羊公羊屠宰后，取腎臟周圍白色脂肪組織，經PBS清洗2～3次后，超凈臺內切碎脂肪組織，在50 mL離心管中加入1∶1體積的PBS（含1%BSA和1%Ⅰ型膠原酶），37℃搖床振蕩酶解1 h，每隔20 min用渦旋振蕩器振蕩1次。酶消化1 h后，1 200 r/min離心5 min，去除上層組織，加入等體積的紅細胞裂解液，裂解紅細胞20 min，離心清洗后加入7 mL DMEM完全培養基，重懸沉淀，以5×106個cell/mL的密度接種于卡式瓶中，于37℃、5%CO2的培養箱中培養，每3 d 換液 1 次[5]。

1.2.2 細胞的傳代培養：首次接種的原代細胞生長至80%～90%匯合時，吸掉上清液，用PBS清洗后加入1 mL胰酶37℃消化1～2 min。待細胞變圓后加入2～3 mL完全培養基，終止消化。輕輕吹吸細胞，1 800 r/min離心5 min，棄上清液。加入1 mL完全培養基重懸，細胞懸液按照1∶3的比例傳代培養。

1.2.3 嶗山奶山羊ADSCs生長曲線的測定：細胞傳至第3代時開始大量凍存細胞，同時選取生長狀態良好的第3、5代細胞，利用胰酶消化制成單細胞懸液，以1×104個cell/孔密度接種于24孔板中，平均分成9組，每組3孔，每天計數3孔細胞，求平均值，至第9組結束。以時間為橫坐標，細胞數量為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.4 Real time RT-PCR鑒定全能性相關基因：采用Transzol up提取第2、3、4代嶗山奶山羊ADSCs的總RNA。反轉錄前首先進行去除基因組DNA 反應， 反應體系為 20 μL：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL、RNA Free dH2O 0.5 μL，反應條件為：42℃、2 min，4℃保存。 將反應產物分裝成10 μL/管之后加入RNase Free dH2O 4.0 μL、5×Prime Script Buffer 2 （for Real time）4.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1.0 μL， 反應條件為：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4℃保存。實時定量 PCR反應體系為 20 μL：2×SYBR Premix EX TaqTM10 μL，上、下游引物各 0.3 μL（10 mol/L），RO×Reference Dye （50×）0.2 μL，RT反應液（cDNA）2 μL、dH2O 7.2 μL。 利用 ABI7500實時定量PCR儀進行PCR反應，反應程序為：94℃預變性 3 min；94℃變性 10 s，60℃退火 25 s，72℃延伸20 s，共40個循環。以Gapdh作為內參基因，采用 2-△△Ct法計算 Oct-4、Sox-2 和 Nanog 基因的mRNA相對表達量。

1.2.5 成骨誘導分化及鑒定：選取第3代ADSCs消化，按2×105個cell/mL密度接種于6孔板中。當細胞達到70%～80%匯合時，倒掉培養液，誘導組更換為誘導培養基 （DMEM/F12＋10%FBS＋10 mmol/L β-甘油磷酸鈉＋20 nmol/L 地塞米松＋50 μg/mL抗壞血酸），對照組則繼續正常培養。每3 d換液1次，觀察細胞的生長情況，連續誘導21 d后，利用茜素紅染色，用150 mmol/L的NaCl溶液沖洗細胞3次，70%冰乙醇4℃固定1 h后水洗3次，2%茜素紅室溫染色10 min，顯微鏡下觀察染色結果。

2 結果與分析

2.1 嶗山奶山羊ADSCs的分離與培養

圖1 嶗山奶山羊ADSCs原代培養及傳代培養結果

嶗山奶山羊原代培養的ADSCs在接種后細胞均懸浮于培養基中，培養1 h左右細胞開始貼壁生長，起初細胞貼壁后生長形態不規則，6 h觀察時，細胞基本全部貼壁，但細胞中仍混有許多雜質，12 h經換液處理后，細胞形態清晰，48 h后貼壁生長的細胞開始大量繁殖，4～5 d時，細胞出現融合成片的趨勢，此時細胞均呈現長梭形及多角形（見圖1A），7～8 d后細胞相互融合，基本鋪滿瓶底，經2～3次傳代培養后，利用酶消化時間差的處理方法，細胞得到進一步純化，且形態基本一致，呈現均一長梭形，4～5 d后細胞生長再次達到80%融合（見圖 1B）。

2.2 嶗山奶山羊ADSCs生長曲線

由圖2可知，嶗山奶山羊ADSCs的生長曲線呈“S”形；第 3、5 代細胞在培養 1～2 d 時，細胞數量沒有較大變化，此時細胞處于潛伏期；培養3 d后細胞開始快速生長，此時進入對數生長期；培養6 d時細胞生長開始減緩；培養7～8 d時，細胞數量基本維持不變，此時細胞生長進入平臺期。

圖2 嶗山奶山羊ADSCs生長曲線

2.3 嶗山奶山羊ADSCs全能性基因Real time RT-PCR結果

Real time RT-PCR結果顯示，第2、3、4代嶗山奶山羊ADSCs中均檢測到Oct-4和Sox-2基因的表達（見圖3A、B），但均未檢測到Nanog基因的表達 （見圖3C）。由圖4可知，2個基因在第2代ADSCs中的表達量均較低，在第3、4代ADSCs中的表達量均較高。

圖3 Oct-4、Sox-2及Nanog基因Real time RT-PCR反應熔解曲線

圖4 第2、3、4代嶗山奶山羊ADSCs中Oct-4和Sox-2基因的mRNA相對表達量

2.4 嶗山奶山羊ADSCs成骨誘導分化結果

ADSCs一般在誘導10 d左右時即可出現明顯的鈣化結節，17 d左右時骨結節最顯著（見圖5 A），經茜素紅染色后被染成深紅色（見圖5 B）。而對照組染色后并未見有深紅色的骨結節出現 （見圖 5 C）。

3 討論與結論

近年來，間充質干細胞作為一種成體干細胞，逐漸成為國內外研究的熱點，因其成熟的體外分離技術和較強的體外分化能力，在組織功能修復和創傷治療方面具有不可替代的優勢[6-8]。脂肪間充質干細胞由于其特定的存在方式和安全性，在美容醫療等方面越來越被接受。同時，由于脂肪組織中間充質干細胞數量較多，取材和處理的方式簡單，且在體外增殖快速，因此，逐步成為成體干細胞研究中常用的組織工程種子細胞，其研究領域逐步延伸到了分子功能機制的水平[9]。

目前，國內外的許多研究已經從多種哺乳動物體內分離得到了脂肪間充質干細胞，但在國內，受限于地域和研究水平的問題，許多地方優良品種的脂肪間充質干細胞未見相關的報道[10]。在該研究中，筆者采用了常規的酶消化脂肪組織的方法，系統探討了嶗山奶山羊脂肪間充質干細胞的分離與培養技術。在該過程中，筆者分離得到了嶗山奶山羊的脂肪間充質干細胞，細胞形態呈長梭形，與成纖維細胞相似。經傳代后檢測，細胞純度較高，在多次傳代后，形態始終保持均一。對第3、5代細胞進行生長曲線測定，在培養1～2 d時，細胞處于潛伏期；3 d后細胞開始快速生長，進入對數生長期；6 d時細胞生長開始減緩，7～8 d時，細胞生長進入平臺期，這與先前的研究結果一致[11-12]。而采用Real time RT-PCR方法對嶗山奶山羊脂肪間充質干細胞的多能性因子進行檢測時，能夠檢測到傳代后Oct-4和Sox-2基因的正常表達，但未檢測到Nanog基因的表達，這說明脂肪間充質干細胞多能性因子表達不全，可能與各種類型的間充質干細胞所存在的組織有關[13]。

在該研究中，筆者采用成骨誘導分化的方法驗證了脂肪間充質干細胞的誘導分化潛能，該方法也是最早被發現的分化驗證方法之一。由于骨來源于中胚層，因此，成骨誘導也被認為是中胚層細胞的誘導能力[14]。該過程涉及多個信號通路的改變，誘導培養基中的地塞米松和β-甘油磷酸鈉是成骨誘導所必需的試劑，地塞米松可以促進誘導成骨分化成熟，同時也可以提高堿性磷酸酶的活性，進而促進細胞外基質中膠原的合成。β-甘油磷酸鈉是一種能夠為成骨細胞提供磷酸離子的物質，可以促進細胞內鈣鹽的沉積和鈣化的形成。采用茜素紅染色后，可以觀察到鈣鹽的沉積，其被染成深紅色，這與前人的研究結果一致[15-16]。該研究未進一步進行基因水平的驗證，但染色結果已經證明了嶗山奶山羊ADSCs具有分化為中胚層骨細胞的能力，這為將其作為模型細胞研究骨損傷修復機制和方法以及作為骨組織工程的種子細胞研究提供了科學依據。

圖5 嶗山奶山羊ADSCs成骨誘導結果

綜合上述結果，該研究建立了成熟、穩定的嶗山奶山羊ADSCs分離、體外培養擴增及定向誘導分化的方法。分離獲得的嶗山奶山羊ADSCs在體外培養時表現出較高的增殖速率和誘導分化潛能，這為臨床移植提供了充足的組織功能研究細胞來源，也為嶗山奶山羊的保種、育種以及基因庫建設提供了理論基礎。