RKIP對前列腺癌PC3細胞侵襲、轉移的影響及機制

趙鵬程，楊 棟，任 樂，何朝宏

(河南省腫瘤醫院,鄭州大學附屬腫瘤醫院泌尿外科，河南鄭州 450003)

前列腺癌是常見的男性生殖系統惡性腫瘤之一[1]，西方發達國家前列腺癌的發病率和死亡率較高，據文獻資料統計，2013年美國前列腺癌新增病例約為24萬、死亡人數約為3萬人，2012年我國腫瘤登記地區前列腺癌的發病率為9.92/10萬，居于男性惡性腫瘤的第6位[2]，還有研究表明，預計到2050年前列腺癌的發病率將增加2.5倍[3]，嚴重威脅男性患者身體健康和生命安全。前列腺癌具有遠端轉移和浸潤生長的特性，嚴重影響患者的生存率，因此，采取有效的措施抑制癌細胞的侵襲和轉移是治療前列腺癌的重要環節。Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitory protein，RKIP)是一種腫瘤轉移抑制基因[4]，有研究表明，RKIP與子宮內膜癌的轉移密切相關[5]。然而，RKIP對前列腺癌細胞侵襲、轉移的影響及相關機制的研究還較少，本研究以人前列腺癌細胞系PC3為研究對象，探究RKIP對前列腺癌細胞侵襲、轉移及磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol kinase，PI3K)/蘇氨酸蛋白激酶(threonine protein kinase，Akt)/核轉錄因子(nuclear transcription factor-kB，NF-kB)通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本及細胞系 隨機選取2015年5月至2017年5月在河南省腫瘤醫院行根治性切除術的前列腺癌組織標本及對應癌旁前列腺組織標本各103例，術后經組織病理檢查均確認為前列腺腺癌患者。人前列腺癌細胞系PC3購自美國ATCC公司。

1.1.2主要試劑與儀器 改良Eagle培養基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培養基購自美國GIBCO公司；脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；TrIzol 試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒和實時定量試劑盒購自英國NEB公司；鼠抗人PI3K、Akt、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated Akt，p-Akt)和NF-kB多克隆抗體購自艾比瑪特醫藥科技(上海)有限公司；48孔細胞培養板和transwell小室購自美國Corning公司；基質膠購自美國BD公司；超低溫離心機(型號3K15)購自德國Sigma公司；奧林巴斯熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；熒光定量PCR儀器購自德國Eppendorf；脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)序列和目標載體由蘇州金唯智生物科技有限公司合成、構建。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將購買的人前列腺癌細胞PC3解凍復蘇，接種于含10%胎牛血清DMEM培養基中，置于37℃、5% CO2的潮濕培養箱中培養，待細胞長滿瓶底85%左右時，棄去培養液，加入胰蛋白酶消化處理后，進行傳代培養和細胞凍存。

1.2.2細胞轉染及分組 取對數期人前列腺癌細胞PC3接種于48孔細胞培養板(100 μL/孔)，待細胞融合度達到85%以上時，用胰蛋白酶消化處理后，按照Lipofectainine2000轉染劑說明書將購買的pcDNA3.0-RKIP、pcDNA3.0、RKIP-shRNA和shRNA-NC轉染至前列腺癌細胞，命名為pcDNA3.0-RKIP組、pcDNA3.0組、RKIP-shRNA組、shRNA-NC組，每組重復9孔，以未經轉染的細胞作為對照組，對照組加入等量的二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，各組細胞均培養48 h。

1.2.3實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR)檢測人前列腺癌細胞PC3中RKIP mRNA表達水平 用TrIzol 試劑提取人前列腺癌細胞PC3的總RNA，并將其反轉成cDNA，根據美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上提交的RKIP的理論序列設計引物，RKIP：上游引物F1，5′-TTGGTGGTGAATATGAAAGG-3′，下游引物R1，5′-TAAGAGTCGTTGGCGAGT-3′；3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物F2，5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物R2，5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′；以GAPDH為內參進行qRT-PCR。反應體系：5×緩沖液 5 μL，TaqDNA聚合酶 0.5 μL，上游引物F 1 μL，下游引物R 1 μL，10 mmol/L脫氧核苷三磷酸混合液(deoxyriboNucleotide triphosphate mix，dNTP mix)0.5 μL，互補DNA(complementary DNA，cDNA)1 μL，滅菌蒸餾水 16 μL；反應條件：預變性：95 ℃ 5 min，變性：95 ℃ 30 s，延伸：62℃ 15 s，40個循環，采用最大二階導數法(2-△△Ct)對數據進行統計，計算RKIP mRNA的相對表達量。

1.2.4Transwell小室檢測人前列腺癌細胞PC3侵襲能力 用DMEM無血清培養基將Matrigel膠稀釋至1 mg/mL，然后取40 μL均勻鋪于transwell小室，37℃靜置30 min。取各組人前列腺癌細胞PC3消化處理后制成單細胞懸液，調整細胞數目為1×106/mL，按每孔100 μL加入到transwell小室，常規培養48 h后取出小室，棄去培養液，用磷酸緩沖液(phosphatic buffer solution，PBS)溶液清洗細胞，每孔加入500 μL 95%乙醇固定15～20 min，經0.1%結晶紫溶液染色30 min后，用棉簽擦拭未穿膜細胞，風干后置于顯微鏡觀察，并記錄穿膜細胞數目，以此作為評判細胞侵襲能力的指標。

1.2.5劃痕實驗檢測人前列腺癌細胞PC3遷移能力 將各組人前列腺癌細胞PC3制成單細胞懸液，調整細胞數目為1×106/ mL接種于細胞培養板(100 μL/孔)，培養24 h，細胞密度達80%時，用滅菌過的200 μL槍頭劃線，用PBS洗去劃痕中的細胞，加入空白培養基，培養24 h后，置于倒置顯微鏡下觀察發生遷移的細胞數目。

1.2.6Western blot檢測RKIP、PI3K、Akt、p-Akt及NF-kB表達情況 分別加入細胞裂解液提取人前列腺癌組織、癌旁組織蛋白及人前列腺癌細胞PC3總蛋白，將蛋白樣品進行加熱煮沸和離心。以GAPDH為內參，取20 μL蛋白質樣品，進行十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel，PAGE)，電泳結束后，半干轉膜儀轉膜50 min，滴加鼠抗人RKIP、PI3K、Akt、NF-kB多克隆抗體，置于4℃下過夜，滴加二抗37℃放置1 h。采用電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)分析法，加入ECL發光劑進行顯影，利用自動凝膠成像系統采集圖像。采用Image J 軟件對 Western blot 條帶進行灰度分析。

1.3統計學分析

2 結 果

2.1RKIP在前列腺癌組織表達情況前列腺癌組

織RKIP蛋白相對表達為(0.64±0.11)顯著低于癌旁組織(1.12±0.22)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2轉染后人前列腺癌細胞PC3中RKIPmRNA和蛋白表達水平shRNA-NC組和pcDNA3.0組PC3細胞中RKIP mRNA和蛋白表達水平與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，RKIP-shRNA組PC3細胞中RKIPmRNA和蛋白表達水平顯著低于對照組和shRNA-NC組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞中RKIP mRNA和蛋白表達水平顯著高于對照組和pcDNA3.0組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞中RKIP mRNA和蛋白表達水平顯著高于RKIP-shRNA組(P<0.05，表1、圖1)。

組別RKIPmRNA蛋白對照組0.68±0.120.71±0.08shRNA-NC組0.70±0.140.66±0.13RKIP-shRNA組0.48±0.08*#0.31±0.09*#pcDNA3.0組0.66±0.150.64±0.12pcDNA3.0-RKIP組0.97±0.18*△&0.93±0.11*△&

RKIP：Raf激酶抑制蛋白。與對照組相比，*P<0.05；與shRNA-NC組相比，#P<0.05；與pcDNA3.0組相比，△P<0.05；與RKIP-shRNA組相比，&P<0.05。

圖1 各組人前列腺癌細胞PC3中RKIP 表達水平

A:各組RKIP mRNA相對表達水平；B:各組RKIP蛋白相對表達水平；C:轉染后人前列腺癌細胞PC3中RKIP蛋白表達情況。RKIP：Raf激酶抑制蛋白；GAPDH:3-磷酸甘油醛脫氫酶。與對照組相比，*P<0.05；與shRNA-NC組相比，#P<0.05；與pcDNA3.0組相比，△P<0.05；與RKIP-shRNA組相比，&P<0.05。

2.3transwell小室檢測人前列腺癌細胞PC3侵襲能力shRNA-NC組和pcDNA3.0組PC3細胞侵襲能力與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，RKIP-shRNA組PC3細胞侵襲能力顯著高于對照組和shRNA-NC組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞侵襲能力顯著低于對照組和pcDNA3.0組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞侵襲能力顯著低于RKIP-shRNA組(P<0.05，表2、圖2)。

組別侵出細胞數目(個)對照組135.12±21.32shRNA-NC組146.37±23.41RKIP-shRNA組476.45±53.72*#pcDNA3.0組128.67±21.24pcDNA3.0-RKIP組 84.27±22.82*△&

圖2 transwell小室檢測人前列腺癌細胞PC3侵襲能力(×400)

2.4劃痕實驗檢測人前列腺癌細胞PC3遷移能力shRNA-NC組和pcDNA3.0組PC3細胞遷移能力與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，RKIP-shRNA組PC3細胞遷移能力顯著高于對照組和shRNA-NC組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞遷移能力顯著低于對照組和pcDNA3.0組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞遷移能力顯著低于RKIP-shRNA組(P<0.05，表3、圖3)。

2.5Westernblot檢測PC3細胞中PI3K、Akt及NF-kB表達情況各組間Akt的表達水平相比，差異無統計學意義(P>0.05)。shRNA-NC組和pcDNA3.0組PC3細胞中PI3K、p-Akt和NF-kB的表達水平與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，RKIP-shRNA組PC3細胞中PI3K、p-Akt和NF-kB的表達水平顯著高于對照組和shRNA-NC組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞中PI3K、p-Akt和NF-kB的表達水平顯著低于對照組和pcDNA3.0組(P<0.05)，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞中PI3K、p-Akt和NF-kB的表達水平顯著低于RKIP-shRNA組(P<0.05，圖4、表4)。

組別發生遷移的細胞數目(個)對照組432.46±68.52shRNA-NC組457.36±52.34RKIP-shRNA組942.38±154.28*#pcDNA3.0組405.56±58.37pcDNA3.0-RKIP組116.52±21.34*△&

與對照組相比，*P<0.05；與shRNA-NC組相比，#P<0.05；與pcDNA3.0組相比，△P<0.05；與RKIP-shRNA組相比，&P<0.05。

圖3 細胞劃痕實驗檢測人前列腺癌細胞PC3遷移能力(×400)

組別PI3KAktp-AktNF-kB對照組0.58±0.120.62±0.110.64±0.120.72±0.13shRNA-NC組0.61±0.100.59±0.100.62±0.130.69±0.15RKIP-shRNA組0.83±0.17*#0.60±0.120.86±0.20*#0.95±0.23*#pcDNA3.0組0.56±0.130.63±0.110.66±0.130.74±0.14pcDNA3.0-RKIP組0.41±0.07*△&0.57±0.100.41±0.08*△&0.51±0.10*△&

PI3K：磷脂酰肌醇激酶；Akt：蘇氨酸蛋白激酶；NF-kB：核轉錄因子。與對照組相比，*P<0.05；與shRNA-NC組相比，#P<0.05；與pcDNA3.0組相比，△P<0.05；與RKIP-shRNA組相比，&P<0.05。

圖4 Western blot檢測PC3細胞中PI3K、Akt、p-Akt和NF-kB表達情況

3 討 論

前列腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，可發生遠端轉移和浸潤生長，侵襲膀胱和精囊，引起陽痿、血尿、血精等癥狀[6]，前列腺癌還會發生骨轉移，進而導致骨痛、骨折或截癱[7]，嚴重影響患者的身體健康，因此，采取有效的措施抑制前列腺癌的侵襲和轉移是治療前列腺癌的重要環節。RKIP作為磷脂酰乙醇胺結合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP)家族中一個成員，能夠與Raf結合抑制其激活[8]。本研究發現，前列腺癌組織RKIP蛋白相對表達顯著低于癌旁組織，且前列腺癌PC3細胞中RKIP蛋白表達顯著低于正常細胞，提示RKIP在前列腺癌中可能為抑癌基因。另有研究表明，RKIP與細胞增殖和侵襲密切相關[9]。張曉梅等[10]研究表明，上調胃癌細胞SGC7901中RKIP基因表達，能夠抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力，并促進胃癌細胞凋亡。褚靜等[11]研究表明，上調宮頸癌細胞RKIP基因的表達，能夠抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力，是宮頸癌治療的新靶點。為進一步明確RKIP在前列癌疾病進展中作用，本研究采用RKIP表達較低的PC3細胞作為研究載體，分別用RKIP-shRNA和pcDNA3.0-RKIP轉染PC3細胞，結果表明，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞RKIP mRNA表達水平顯著高于RKIP-shRNA組和對照組，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞侵襲和遷移能力顯著低于RKIP-shRNA組和對照組，表明上調PC3細胞RKIP基因的表達，能夠抑制前列腺癌細胞的侵襲和轉移能力，與張曉梅等[10]在胃癌細胞中研究一致，但其機制尚不清楚。

RKIP的表達水平與生物體中重要的信號通路密切相關[12]。PI3K/Akt是生物體內重要的信號通路，其活性涉及多個基因的調控，參與腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡等過程[13]。黃海等[14]研究表明，激活前列腺癌細胞LNcap中PI3K/Akt信號通路的活性能夠促進前列腺癌細胞的增殖，并抑制前列腺癌細胞凋亡。賈艷菊等[15]研究表明，抑制前列腺癌細胞中PI3K/Akt信號轉導通路，能夠抑制前列腺癌細胞的生長、增殖以及分化。NF-kB是PI3K/Akt信號轉導通路下游的關鍵蛋白，與細胞增殖、分化、侵襲和轉移密切相關。BUFU等[16]研究表明，南蛇藤酮可通過抑制PI3K/Akt 信號通路活性抑制直腸癌細胞MMP蛋白表達，進而抑制細胞增殖和遷移能力，促進細胞凋亡。CHIU 等[17]研究表明，下調前列腺癌細胞中Akt/NF-kB信號通路活性，能夠抑制人前列腺癌細胞的侵襲。LIU等[18]發現，RKIP過表達可顯著抑制NF-kB通路的激活，增強胃癌細胞對順鉑的敏感性。本研究顯示，pcDNA3.0-RKIP組PC3細胞中PI3K、p-Akt和NF-kB的表達水平顯著低于RKIP-shRNA組，表明RKIP過表達能夠抑制PI3K/Akt/NF-kB信號通路的活性，提示RKIP過表達對前列腺癌細胞侵襲和轉移的抑制作用可能與抑制PI3K/Akt/NF-kB信號通路激活有關。

綜上所述，RKIP過表達能夠抑制前列腺癌細胞侵襲和轉移，可能通過抑制PI3K/Akt/NF-kB通路激活實現，為前列腺癌的靶向治療提供一定的理論依據。