金針菇中麥角硫因的分離純化工藝優(yōu)化

莫宇麗 張怡馨 王 艷 胡晶晶 李亞歡 王 杰

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

麥角硫因?qū)W名為2-巰基-L-組氨酸三甲基內(nèi)鹽，是一種新型的天然強抗氧化劑，在食品添加劑、保健品、化妝品等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[1-4]。金針菇等常見食用菌中麥角硫因的含量高且具有天然安全性，是制備麥角硫因的良好資源[5-6]。保健品、化妝品等產(chǎn)品對麥角硫因的純度有較高的要求，而采用浸提法等提取的麥角硫因中含有較多的雜質(zhì)，影響其在產(chǎn)品中的應(yīng)用效果[7]。因此，研究金針菇中麥角硫因的純化工藝條件，可為食用菌麥角硫因的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。目前，國內(nèi)外對麥角硫因的研究多集中于功能特性[8-11]，而提取方面的報道也多為水或其他溶劑的簡單浸提，純化方面的研究有待于進(jìn)一步開展[7，12-14]。

前期研究表明，溶劑浸提法所得到的食用菌麥角硫因提取液中含有較多蛋白和多糖類物質(zhì)，而柱層析法可以有效去除蛋白、多糖類物質(zhì)[15]。葡聚糖凝膠分離條件溫和，樣品回收率高，且設(shè)備簡便、易于操作，易推廣[16]。試驗在比較三種葡聚糖凝膠和五種大孔吸附樹脂對金針菇麥角硫因提取液的純化效果基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化Sephadex G-10的純化條件，確定金針菇麥角硫因的純化工藝條件。研究結(jié)果可為金針菇中麥角硫因的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

金針菇，由廣東藍(lán)田農(nóng)業(yè)有限公司提供；高效液相色譜儀（LC2130），真空冷凍干燥機（FD-1-50），高效液相色譜柱（AQ-C18），數(shù)顯恒流泵（HL-2B），1.6 cm×40 cm層析柱，紫外可見分光光度計（UV-4802S）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

取新鮮金針菇洗凈、分裝于冰箱中冷凍12 h，然后放于真空冷凍干燥機中干燥至恒重，最后粉碎成粉末，過篩，置于-20℃冰箱中備用。

用62%乙醇以料（g）液（mL）比1∶58與金針菇粉充分混合，在53℃條件下水浴浸提15 min，取出后于12 000×g離心10 min，收集上清液；使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，濃縮至原體積的1/5，收集濃縮液。向麥角硫因濃縮液中加入四倍體積的95%乙醇（緩慢加入，邊加邊攪拌），混合均勻后于4℃靜置12 h；離心，取上清液再次減壓蒸餾濃縮至最小體積，收集濃縮物并添加去離子水至上清液體積的1/5，即為醇沉后的濃縮液，用于后續(xù)純化。

1.2.2 不同葡聚糖凝膠對金針菇麥角硫因提取液的純化

取預(yù)處理過的葡聚糖凝膠Sephadex G-10、Sephadex G-25、Sephadex G-75，裝柱，柱規(guī)格均為20 cm×1.6 cm；將醇沉后的濃縮液以2 mL的上樣液和1 mL/min的洗脫速度進(jìn)行上樣和洗脫，用10 mL離心管收集洗脫液，3 mL/管，收集30管。測定每管的蛋白、多糖及麥角硫因含量，每管做三個平行。比較不同的葡聚糖凝膠對麥角硫因提取液的分離純化效果。

圖1 不同葡聚糖凝膠洗脫液中蛋白、多糖、麥角硫因的含量

1.2.3 不同大孔樹脂對金針菇麥角硫因提取液的純化

將預(yù)處理好的S-8、AB-8、D101、HP-20、NKA-9五種大孔樹脂各2 g，置于藍(lán)蓋瓶中，分別加入10 mL樣品液，置于25℃搖床中，轉(zhuǎn)速150 r/min，振蕩24 h。取上清液檢測麥角硫因含量后將樹脂、樣品液混合物抽濾，并用一級水清洗抽濾后的樹脂。分別加入20 mL 60%乙醇，于25℃搖床中，轉(zhuǎn)速150 r/min解吸12 h，每隔1 h吸取1 mL解吸液，檢測解吸液的蛋白、多糖、麥角硫因含量，比較不同的大孔樹脂對麥角硫因提取液的純化效果。

1.2.4 蛋白質(zhì)、多糖、麥角硫因的測定方法

（1）蛋白質(zhì)的測定：采用考馬斯亮藍(lán)法測定分離液中的蛋白質(zhì)含量。

（2）多糖的測定：采用苯酚-硫酸法測定分離液中的多糖含量。

（3）麥角硫因的測定：采用高效液相色譜法檢測麥角硫因的含量。檢測條件：色譜柱（Luna 5μm C18（2）100A，Phenomenex）大小為250 mm×4.6 mm，流動相為水∶甲醇=98∶2，流速為1 mL/min，檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量為20μL。將麥角硫因分離液和標(biāo)準(zhǔn)品按上述條件測定。以麥角硫因濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（μAU*s）（星號代表乘號）為縱坐標(biāo)，繪制麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 正交試驗優(yōu)化SephadexG10純化麥角硫因的條件

在前期研究基礎(chǔ)[15]上，選取凝膠層析柱高度、洗脫液流速和上樣量三個影響葡聚糖凝膠分離效果的因素，以這三因素用SPSS軟件設(shè)計三因素三水平正交試驗（以麥角硫因回收率為檢測指標(biāo)），因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

對正交試驗的結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析以確定純化方法的最優(yōu)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡聚糖凝膠對金針菇麥角硫因提取液的分離純化

試驗中欲分離的麥角硫因的分子量為229.3 Da，由于提取液中的其他雜質(zhì)分子量不明確，同時為了能達(dá)到更好的分離效果，所以選取了分離范圍較有代表性的Sephadex G-10、Sephadex G-25和Sephadex G-75分別對麥角硫因提取液進(jìn)行分離純化。由圖1可見，在柱體積為20 cm×1.6 cm、上樣量為2 mL和洗脫速度為1 mL/min的相同條件下，Sephadex G-75的分離效果是最差的，蛋白質(zhì)、多糖和麥角硫因的出峰管幾乎重疊，三種物質(zhì)都集中在10-20管中被洗脫出來，對于麥角硫因起不到任何分離純化作用；G-25和G-10對提取液中麥角硫因的分離效果相似，但經(jīng)G-25洗脫的麥角硫因集中度不高，主要集中在10-16管，根據(jù)峰型可以看出G-25對多糖的純化效果更好，并且多糖和麥角硫因的峰值出現(xiàn)點重合度更高；相比之下G-10對麥角硫因的分離效果更好一些，集中度高，在6-10管并且與多糖、蛋白的峰值重合度也沒有G-25高。

2.2 不同大孔樹脂對金針菇麥角硫因提取液的純化

圖2為五種大孔樹脂S-8、AB-8、D-101、HP20和NKA-9處理提取液之后，用60%乙醇解吸12 h內(nèi)解吸液中的蛋白、多糖、麥角硫因含量變化（還包括解吸24 h時麥角硫因的含量）。結(jié)果顯示五種大孔樹脂對麥角硫因的吸附率均不足60%，其中吸附率最高的是AB-8，達(dá)到58.86%。然而就解吸率而言，五種大孔樹脂由于各自極性不同，解吸率最高的時間點也不同，大孔樹脂D-101解吸液中蛋白質(zhì)含量在第3 h突然增高，這有可能是由于提取液中的蛋白質(zhì)含量較高，大孔樹脂D-101吸附了較多的蛋白質(zhì)，在解吸過程的第3個小時，大量的蛋白質(zhì)從大孔樹脂D-101中被解吸出來，從而導(dǎo)致其蛋白含量的突然增高。對于麥角硫因的含量，分別按照五種樹脂解吸率最高的時間點來計算，其解吸率也都較低，最高的是S-8，也僅有5.42%，并且吸附率最高的AB-8的解吸率最低，僅有1.84%。影響大孔樹脂吸附性能的因素有很多，不僅與大孔樹脂自身的三維結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與被吸附物質(zhì)的分子大小和極性有關(guān)[17-20]。雖然可以增加大孔樹脂的用量來提高麥角硫因吸附，但解吸率過低，意味著需要消耗大量的解吸液，這又將涉及解吸液的濃縮，而對大量解吸液進(jìn)行再濃縮是非常耗時的。因此，與葡聚糖凝膠分離從操作簡易程度、耗時、耗能等方面相比均不具有優(yōu)勢，故采用葡聚糖凝膠G10對金針菇麥角硫因提取液進(jìn)行分離純化。

圖2 不同大孔樹脂解吸液中蛋白、多糖、麥角硫因的含量

2.3 正交試驗優(yōu)化SephadexG-10純化麥角硫因的條件

根據(jù)表1通過SPSS.19設(shè)計正交試驗進(jìn)行純化方法的優(yōu)化，得到用Sephadex G-10層析柱純化提取液中麥角硫因的正交試驗及其結(jié)果見表2。

表2 葡聚糖凝膠G-10純化金針菇提取物中麥角硫因的正交試驗

表3 以麥角硫因回收率為指標(biāo)的極差分析

表2、3分別為Sephadex G-10層析柱純化金針菇提取物中麥角硫因的正交試驗設(shè)計表和以麥角硫因回收率為指標(biāo)的極差分析表。根據(jù)表2、表3，由R值大小可以判斷，柱高（A，cm）、流速（B，mL/min）和上樣量（C，mL）這三個因素對Sephadex G-10分離純化金針菇中麥角硫因回收率的影響力的主次順序是A＞C＞B，即凝膠層析柱高＞上樣量＞洗脫流速。利用K值得出最優(yōu)分離條件為A2B1C2。因此通過試驗可以確定所得樣品液中麥角硫因回收率最高的分離條件為：凝膠層析柱高為20 cm，樣品液上樣量為2 mL，洗脫速度為0.5 mL/min。凝膠柱的柱高對分離后的回收率影響相對較大，理論上而言凝膠層析柱越長，分離效果越好；但當(dāng)柱過高時，也容易導(dǎo)致實驗時間長，樣品稀釋度增大，分離效果反而不好。

表4 以麥角硫因回收率為指標(biāo)的方差分析表

表4是以麥角硫因回收率為指標(biāo)的方差分析。由表4，F(xiàn)檢驗結(jié)果表明，三個因素對提取液麥角硫因回收率的影響均呈不顯著。這可能是由于實驗的誤差較大，或者是三種因素間的交互作用對檢驗值的影響更大。故根據(jù)極差分析的結(jié)果直接使用回收率最高的條件作為純化條件：凝膠層析柱高為20 cm，樣品液上樣量為2 mL，洗脫速度為0.5 mL/min；以此條件做三次重復(fù)試驗，得到的回收率平均值為93.98%。收集純化后的洗脫液，進(jìn)行濃縮、凍干得到干物質(zhì)，稱重，再將干物質(zhì)溶解、稀釋，上樣測定麥角硫因的濃度，最后得到其純度（麥角硫因/干物質(zhì)質(zhì)量）平均值為54.83%，純化后的麥角硫因最終產(chǎn)量為3.05 mg/g（干重）。

3 結(jié)論

所選的三種葡聚糖凝膠和五種大孔吸附樹脂中，葡聚糖凝膠Sephadex G-10對提取液中麥角硫因的分離純化效果最好，對其進(jìn)行純化條件優(yōu)化，得出最優(yōu)純化條件為：凝膠層析柱柱高為20 cm，樣品液上樣量為2 mL，洗脫速度為0.5 mL/min。該方法對麥角硫因的回收率高，其回收率可達(dá)93.98%，且能夠很大程度地減少純化過程中麥角硫因的損失，純化后的麥角硫因的純度為54.83%，產(chǎn)量為3.05 mg/g干重。此方法具有回收率高、操作簡便等優(yōu)點，可為麥角硫因提取液的進(jìn)一步純化提供科學(xué)依據(jù)與參考，促進(jìn)金針菇中麥角硫因的利用，提高其應(yīng)用價值。金針菇麥角硫因是一種天然抗氧化劑，安全無毒無副作用，在今后的研究中有待進(jìn)一步分離純化，并對其抗氧化性質(zhì)進(jìn)行更深的研究。