裂褶菌液體培養(yǎng)條件優(yōu)化及其發(fā)酵液功效檢測(cè)

邴 雪 甄英鑫 史豆豆 安 全 蘇 寧 王昌濤 李 萌

（1北京工商大學(xué)理學(xué)院∕北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048；2云南白藥集團(tuán)有限公司，云南昆明650118；3中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院化妝品技術(shù)中心，北京朝陽(yáng)100176；4北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京海淀100048）

裂褶菌（Schizophyllum commun）別名樹花、雞毛菌、白花、白參等，屬于真菌門，擔(dān)子菌綱，傘菌目，裂褶菌科，裂褶菌屬（Schizophyllum）[1]。在段木栽培木耳、香菇及銀耳或者毛木耳有時(shí)產(chǎn)生的“雜菌”——裂褶菌，其繁殖速度快，繁殖量大，嚴(yán)重時(shí)，還可使木質(zhì)部產(chǎn)生白色腐朽。世界各地均有裂褶菌分布，在我國(guó)主要分布于河北、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、安徽、江蘇、浙江、湖南、甘肅、福建、海南、四川、貴州等省區(qū)。據(jù)云南省農(nóng)科院測(cè)試中心對(duì)人工栽培的裂褶菌分析，裂褶菌中人體必需的8種氨基酸總含量達(dá)17.04%，并富含鋅、鐵、鉀、鈣、磷、硒、鍺，有較高的藥用價(jià)值。據(jù)《新華本草綱要》等籍記載，此菌“性平，味甘，氣味（根）苦、微寒、無毒”。對(duì)小兒盜汗、婦科疾病、神經(jīng)衰弱、頭昏耳鳴等癥療效明顯。裂褶菌是食藥兼用的珍稀菌，有清肝明目，滋補(bǔ)強(qiáng)身的功效。國(guó)外對(duì)裂褶菌的遺傳、生理研究開展較早，我國(guó)則側(cè)重研究菌絲體的發(fā)酵條件、人工馴化栽培和藥用價(jià)值[2]。

裂褶菌素是由裂褶菌分泌的胞外多糖，是以主鏈為β-（1，3）糖苷鍵連接，支鏈β-（1，6）連接的β葡聚糖[3]，具有β-1，3-D葡聚糖的獨(dú)特結(jié)構(gòu)活性和良好的水溶性，在調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗輻射等方面具有顯著的效果。裂褶菌素具有的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特性，使其生物活性高于其他真菌多糖。夏冬等發(fā)現(xiàn)裂褶菌多糖對(duì)延緩衰老有幫助原因是它可以促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞免疫功能和機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，并在恢復(fù)老年動(dòng)物細(xì)胞免疫及體液免疫的功能方面有良好表現(xiàn)[4]。張雖栓等人研究表明，以酵母粉0.8%和硝酸銨0.2%為混合氮源，加入3-吲哚乙酸0.04%、磷酸二氫鉀0.3%、葡萄糖12%的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲，接種量為13%的發(fā)酵條件下多糖提取率較高，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)1.768%[5]。張琪等人研究裂褶菌多糖的保濕成分，結(jié)果表明其能作為護(hù)膚保濕產(chǎn)品添加物，其保濕能力較常見的保濕劑成分燕麥β-葡聚糖強(qiáng)，可以開發(fā)作為日用化妝品中的保濕劑成分[6]。故裂褶菌素在食品生產(chǎn)、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物、化妝品等方面應(yīng)用廣泛。試驗(yàn)對(duì)裂褶菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高裂褶菌素的產(chǎn)量，并在優(yōu)化培養(yǎng)基條件下得到的發(fā)酵液進(jìn)行性質(zhì)檢測(cè)，分析其抗氧化和美白功效，為研究開發(fā)相關(guān)化妝品提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試裂褶菌菌株

裂褶菌菌株來源于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，編號(hào)5.120。

1.2 試劑與儀器

葡萄糖，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；玉米淀粉、糊精、蔗糖、剛果紅、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏，上海麥克林生化科技有限公司；KH2PO4、MgSO4、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉，北京化學(xué)試劑公司；黃豆餅粉，市售；花生餅粉，市售；濃硫酸，北京化工廠；牛血清蛋白，天津凱茵科技有限公司；L-酪氨酸酶，上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 裂褶菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.1 單因素法優(yōu)化培養(yǎng)基

分別以碳源、氮源和pH為單因素，以裂褶菌菌體干重和裂褶菌素含量為考察指標(biāo)，對(duì)裂褶菌培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。碳源有葡萄糖、淀粉、糊精、蔗糖，氮源有黃豆餅粉、花生餅粉、酵母粉、牛肉膏，pH為4、5、6。每組試驗(yàn)進(jìn)行三個(gè)平行。先在1000 mL錐形瓶中配好所需培養(yǎng)基，完全溶解后，分裝于250 mL錐形瓶中，裝液量為100 mL，在28℃培養(yǎng)96 h。檢測(cè)其菌體干重，發(fā)酵液14 800×g離心10 min后，棄上清液，取沉淀置于已知質(zhì)量的培養(yǎng)皿中，在40℃的烘箱中烘干至恒重，得菌絲體干重，并對(duì)裂褶菌發(fā)酵液中的裂褶菌素進(jìn)行檢測(cè)，篩選出最適宜的碳源、氮源和pH。

1.3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基

采用正交試驗(yàn)L9（34）分析法探究裂褶菌最優(yōu)培養(yǎng)基，因素及水平見表1。按表1在1000 mL培養(yǎng)基中加入相應(yīng)量的玉米淀粉和酵母浸粉，完全溶解后，分裝于250 mL錐形瓶中，裝液量為100 mL，在28℃培養(yǎng)96 h。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.4 發(fā)酵液活性成分含量測(cè)定

1.4.1 多糖含量的測(cè)定

還原糖含量的測(cè)定：利用DNS法[7]。取發(fā)酵液1.0 mL于試管中，加DNS試劑2.0 mL，沸水煮沸2 min，冷卻后用水補(bǔ)足到15 mL，在540 nm處測(cè)定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出葡萄糖濃度，求出樣品中糖含量。

多糖含量的測(cè)定：采用苯酚-硫酸法[8]。取發(fā)酵液2.0 mL放入試管中，以去離子水做空白對(duì)照，加入5%的苯酚溶液1.0 mL混勻，再加入5.0 mL濃硫酸，5 min后，封管沸水浴加熱1 h。取出后冷卻至室溫，在490 nm處測(cè)吸光度。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用福林酚法[9]。取1.0 mL發(fā)酵液，加入5.0 mL配好的Na2CO3、NaOH、酒石酸鉀鈉與硫酸銅溶液，迅速混合放入25℃水浴鍋，水浴保溫10 min。加入0.5 mL配好的福林酚試劑，立即混合，25℃水浴反應(yīng)30 min，在700 nm處測(cè)吸光度。

1.4.3 裂褶菌素含量的測(cè)定

采用剛果紅法[10]。取2.0 mL發(fā)酵液于試管中，加入4.0 mL配好的剛果紅溶液，25℃水浴反應(yīng)10 min，在550 nm處測(cè)吸光度。

1.5 發(fā)酵液功效測(cè)定

1.5.1 酪氨酸酶活性抑制率

對(duì)酪氨酸酶活性抑制試驗(yàn)[11]。按照表2中的數(shù)據(jù)添加L-酪氨酸、發(fā)酵液、PBS溶液；C2管在37℃水浴鍋中水浴加熱10 min，波長(zhǎng)475 nm下調(diào)零，C1管37℃水浴10 min后，加1 mL100 U∕mL酪氨酸酶，繼續(xù)水浴10 min，測(cè)定C1吸光度值；同樣方法，以T2調(diào)零測(cè)定T1吸光度值；計(jì)算樣品對(duì)酪氨酸酶的活性抑制率。

表2 溶液配制列表 mL

1.5.2 抗氧化試驗(yàn)

對(duì)DPPH自由基清除作用試驗(yàn)[12]。以制得的發(fā)酵液為待測(cè)液，取等體積的待測(cè)液與2×10-4mol∕L的DPPH溶液混勻（A1管）；取等體積的水與2×10-4mol∕L的DPPH溶液混勻（A2管）；取等體積的無水乙醇與待測(cè)液混勻（A3管）；反應(yīng)30 min后，在517 nm下測(cè)A1、A2、A3管吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂褶菌培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)?shù)垂潭榻湍附郏琾H設(shè)定為4，碳源為葡萄糖、玉米淀粉、糊精、蔗糖，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。當(dāng)碳源固定為葡萄糖，pH設(shè)定為4，氮源為酵母浸粉、牛肉膏、花生餅粉、黃豆餅粉，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。氮源固定為酵母浸粉，碳源固定為葡萄糖，pH設(shè)為4、5、6，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基碳源為玉米淀粉，氮源為酵母浸粉，pH為4時(shí)，裂褶菌菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)最好，菌體干重最大，且裂褶菌的發(fā)酵液中裂褶菌素的產(chǎn)量最高。

2.1.2 正交試驗(yàn)法優(yōu)化結(jié)果

試驗(yàn)以裂褶菌菌絲干重和發(fā)酵液裂褶菌素含量為考察指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。

圖1 培養(yǎng)基不同碳源試驗(yàn)結(jié)果

圖2 培養(yǎng)基不同氮源試驗(yàn)結(jié)果

圖3 培養(yǎng)基不同pH試驗(yàn)結(jié)果

圖4 酪氨酸酶抑制率

由表3、表4可知，影響裂褶菌菌絲干重和裂褶菌素含量的因素主次序均為碳源＞氮源＞pH，試驗(yàn)最優(yōu)培養(yǎng)條件為玉米淀粉30 g，酵母浸粉4 g，pH 4，裂褶菌菌絲干重為0.21 g，裂褶菌素的含量為2.13 mg∕mL。

2.2 發(fā)酵液活性成分

測(cè)得還原糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.924x+0.0523，R2=0.9985，多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.923x+0.025，R2=0.997，多糖含量為 2.14 mg∕mL。測(cè)得蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0013x+0.0031，R2=0.9986，蛋白質(zhì)含量為 3315.00 μg∕mL。測(cè)得裂褶菌素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.038x+0.0136，R2=0.997，裂褶菌素含量為2.13 mg∕mL。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 酪氨酸酶活性抑制試驗(yàn)結(jié)果

選用1%熊果苷溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，1%熊果苷的酪氨酸酶抑制率為95.08%，未稀釋發(fā)酵液的酪氨酸酶抑制率為47.83%。

2.4 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

選用濃度為1%的VC水溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，DPPH自由基清除率為90.84%。發(fā)酵液的DPPH自由基清除率如圖5所示。由圖5可知，未稀釋發(fā)酵液的DPPH自由基清除率為99.20%。

圖5 發(fā)酵液DPPH自由基清除率

3 小結(jié)

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)選擇碳源為玉米淀粉，氮源為酵母浸粉時(shí)，裂褶菌菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)最為良好，菌絲體干重最大，且裂褶菌的發(fā)酵液中裂褶菌素的產(chǎn)量最高。正交試驗(yàn)表明1000 mL培養(yǎng)基中加入玉米淀粉30 g，酵母浸粉4 g，pH 4，獲得裂褶菌菌絲體干重、裂褶菌素的含量最高，分別為0.21 mg∕mL，2.13 mg∕mL。未稀釋發(fā)酵液對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率達(dá)到47.83%，說明發(fā)酵液可以很好地抑制酪氨酸酶的活性。發(fā)酵液的DPPH自由基清除率達(dá)到99.20%，可以充當(dāng)自由基清除劑。試驗(yàn)結(jié)果為開發(fā)裂褶菌發(fā)酵類化妝品提供參考。