硒對液體培養黃綠蜜環菌菌絲體生物量的影響初探

周連玉 更尕求卓 唐德華 米 琴

（青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室∕青海師范大學生命科學學院，青海西寧810008）

目前食物向多樣化發展，人們已注意膳食的合理搭配以及常量元素與微量元素的攝入比例。在缺乏的必需微量元素中，硒缺乏就在其中之一，硒是人體谷胱甘肽過氧化物酶的活性成分，硒能調節氧化還原反應速度，強化某些酶系統的活性及調節維生素A、C、E、K在體內吸收和消化；還可對汞、鎘等重金屬具有解毒作用[1]。無機硒在體內不易吸收且毒性強，人體對有機硒的吸收率比無機硒高30%，毒性也小，并且可以在人體組織內儲存[2]。而許多生物能使添加的外源無機硒轉化為易被體內吸收利用的有機硒。

近年來國內的研究發現，杏鮑菇、靈芝、雞腿菇、平菇、灰樹花等多種食藥用菌具有較強的富硒能力，然而不同種蕈菌液體耐硒能力有差別，其菌絲體生長受菌株特性、培養基、硒濃度、加硒時間、培養時間、pH、接種量、搖床轉速、裝液量等多種因素的影響[3-7]。有許多研究表明：不同菌株在一定硒濃度下富硒后能提高發酵液或菌絲體的營養價值及活性作用[8-11]，還轉化硒的形態[4]，因此可作為補硒營養品和應用于高附加值的食品中[12-13]。

黃綠蜜環菌（Armillaria luteo-virens）是一種大型真菌，隸屬于擔子菌亞門，層菌綱，口蘑目，口蘑科，蜜環菌屬。在青海主要生長在海拔3000～4300 m的草甸上，大多分布于海北（祁連、海晏、剛察）、黃南（澤庫、河南）、海南（共和、貴德、興海）、果洛（瑪沁、甘德、久治）及高海拔的玉樹地區；以及四川、西藏、河北、陜西、甘肅等省區也有分布[14]。目前黃綠蜜環菌還屬于野生菌，因此無法進行人工栽培。研究多集中于其生物學特征、人工培養、化學成分分析、分子鑒定、生態特性等方面[15-24]。利用黃綠蜜環菌生物轉化法生產特定物質的相關報道很少，在一定轉化體系中黃綠蜜環菌可生物轉化合成天麻素[25-26]，LIU J等[27]發現黃綠蜜環菌ZJUUQH100-6菌株在適宜條件下可以將白樺脂醇轉化合成白樺脂酸。試驗研究亞硒酸鈉對黃綠蜜環菌液體培養菌絲體生物量的影響，旨在為黃綠蜜環菌富硒的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株

黃綠蜜環菌菌株HM，由青海師范大學微生物實驗室提供。

1.1.2 培養基

活化菌株采用PDA培養基，配方為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL。種子培養基采用PDB，配方為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL。發酵培養基：蔗糖4%，牛肉膏0.10%，KH2PO40.10%，MgSO40.10%。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體菌種的制備

250 mL三角瓶中裝入種子培養基100 mL，將3塊4 mm的菌塊接到培養液中，于25℃培養4 d。

1.2.2 不同硒濃度對黃綠蜜環菌菌絲體生物量的影響

以15%的接種量將液體菌種接到含亞硒酸鈉的濃度分別為0 mmol∕L（CK）、0.20 mmol∕L、0.40 mmol∕L、0.60 mmol∕L、0.80 mmol∕L、1.00 mmol∕L 的發酵培養基中。25℃培養8 d，測定富硒黃綠蜜環菌菌絲體生物量。每個濃度設三次重復。

1.2.3 添加硒時間對黃綠蜜環菌菌絲體生物量的影響

以15%的接種量將液體菌種接入發酵培養基，以上述試驗確定的適宜硒濃度后，將分別在0 d、2 d、4 d、6 d時將亞硒酸鈉添加到發酵培養基，重復3次。25℃培養8 d，測定富硒黃綠蜜環菌菌絲體生物量。

1.2.4 硒對黃綠蜜環菌菌絲體動態性的影響

以最適硒濃度、最適添加硒時間進行黃綠蜜環菌深層富硒動態培養。分別以添加亞硒酸鈉和不加硒的發酵培養基為富硒處理組與對照組，25℃培養，在發酵時間5 d、6 d、7 d、8 d時，分別對富硒處理組與對照組進行取樣，重復三次，測定黃綠蜜環菌菌絲體生物量。

1.3 菌絲體生物量的測定

培養液過濾獲得菌絲體和發酵液，并用蒸餾水反復清洗菌絲體至濾液無色，菌絲體于60℃干燥至恒重，電子天平稱重測得菌絲體生物量。

1.4 統計分析

試驗數據結果均采用平均值±標準誤表示，不同硒濃度處理下菌絲體生物量和不同加硒時間下菌絲體生物量差異性比較用SPSS 16.0統計分析軟件進行單因素方差分析（LSD，P＜0.05）。加硒組和對照組菌絲體生物量動態性的顯著性通過獨立樣本的t-test進行檢測。

2 結果與分析

2.1 不同硒濃度對黃綠蜜環菌菌絲體生物量的影響

不同硒濃度對黃綠蜜環菌菌絲生長的影響結果如圖1所示。供試黃綠蜜環菌菌絲在5種加硒培養基里均能生長，而硒濃度為0.80 mmol∕L能顯著提高黃綠蜜環菌菌絲體生物量（P＜0.05），但其他硒濃度與對照之間不存在顯著性差異。

圖1 不同硒濃度對黃綠蜜環菌菌絲體生物量的影響

2.2 不同加硒時間對黃綠蜜環菌菌絲體生物量的影響

由2.1試驗結果確定適宜硒濃度為0.80 mmol∕L，探討不同加硒時間對黃綠蜜環菌菌絲體生物量的研究，結果如圖2所示，與不加硒相比，除第6天時加硒組與不加硒組之間不存在顯著性差異，其他時間加硒顯著提高黃綠蜜環菌菌絲體生物量（P＜0.05），而第4天加硒菌絲體生物量增長最大，達到9.32%。

圖2 不同加硒時間對黃綠蜜環菌菌絲體生物量的影響

2.3 硒對黃綠蜜環菌菌絲體生物量累積動態的影響

黃綠蜜環菌菌絲體生物量動態變化如圖3所示，富硒組與對照組的菌絲生長動態規律基本一致。于發酵時間5 d、6 d、8 d時加硒組與不加硒兩者之間的菌絲體生物量干重不存在顯著性差異。與對照組相比，在培養時間第7天時硒顯著提高黃綠蜜環菌菌絲體生物量（P＜0.05），且增長幅度達到33.33%。

圖3 不同發酵時間硒對黃綠蜜環菌菌絲體生物量的影響

3 小結與討論

食藥用菌富硒菌絲體生物量與硒濃度密切相關，硒濃度不同所起到促進或抑制的作用也各異[6-7]。本試驗發現，發酵培養基中添加硒后，黃綠蜜環菌的菌球呈現紅色（有些菌球內層紅色外層為白色），當硒濃度0.80 mmol∕L時，顯著提高菌絲體生物量的含量（P＜0.05，圖1），可見，在適宜硒濃度下可促進黃綠蜜環菌菌絲生長。

將濃度為100 μg∕mL亞硒酸鈉分別于第1天、第3天、第5天加到靈芝發酵培養基中，結果加硒時間為第1天時，靈芝菌絲體生物量最高且發酵液的顏色正常為淺黃色[28]。發現在黃綠蜜環菌培養第4天時加0.80 mmol∕L亞硒酸鈉顯著提高菌絲體生物量（P＜0.05，圖2）。

張炎灼等[29]通過添加3 μg∕mL亞硒酸鈉于秀珍菇液體培養基中研究菌絲體動態變化規律，發現對照組與富硒組生長趨勢基本一致，于培養72 h時菌絲體生物量達到最大值，分別為1.81 mg∕mL和1.92 mg∕mL，但兩者之間不存在顯著性差異。發現黃綠蜜環菌于發酵時間7 d時，富硒組菌絲體生物量顯著高于對照組，而在發酵時間5 d、6 d和8 d時富硒組生物量略大于對照組（P＜0.05，圖3），這一結果也表明了適當硒濃度能促進黃綠蜜環菌菌絲體生長。

總之，硒對食藥用菌菌絲體生物量有明顯的影響，有關硒對黃綠蜜環菌營養成分的作用有待于進一步研究。