北京地區人工栽培羊肚菌的鑒定

賀國強 魏金康 鄧德江* 胡曉艷 吳尚軍 張國慶

（1北京市農業技術推廣站，北京100029；2北京農學院，北京102206）

羊肚菌（Morchella）是一種珍稀且美味的食藥兼用菌，于1818年被發現，在分類上隸屬于子囊菌門、子囊菌綱、盤菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬。全球范圍內羊肚菌被視為珍貴的食用菌，是我國重要的出口食用菌產品之一。

羊肚菌分布范圍較為廣泛，世界上記載的羊肚菌共有28個種[1]，分布于亞洲、歐洲、北美洲及大洋洲的一些地區。其中我國記載羊肚菌屬有11個種[2]，分別為：黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps）、肋脈羊肚菌（Morchella costata）、粗腿羊肚菌（Morchella crassipes）、小羊肚菌（Morchella deliciosa）、高羊肚菌（Morchella elata）、高羊肚菌紫褐變種（Morchella elata var.purpurascens）、羊肚菌（Morchella esculenta）Pers.））、羊肚菌堅挺變種（Morchella esculenta var.rigida）、羊肚菌褐赭色變種（Morchella esculenta var.umbrina）、薄棱羊肚菌（Morchella miyabeana）、普通羊肚菌（Morchella vulgaris）。

羊肚菌的馴化栽培最早始于法國，距今已有130余年的歷史[3]。1982年美國的Ron Ower等首次獲得了室內栽培形成的羊肚菌子實體[4]，隨后美國利用工廠進行了數年的羊肚菌產業化栽培，但由于某些原因以失敗告終。本世紀初我國也成功實現了人工栽培羊肚菌，并開創了羊肚菌大田栽培模式，對于羊肚菌產業化有重要意義。

根據菌蓋近中部與菌柄是否分離、菌蓋邊緣是否明顯向外伸展、菌蓋的形狀和顏色、蓋表棱紋排列和凹坑的深淺等特征，羊肚菌屬分為3個大類：黑色羊肚菌類、黃色羊肚菌類和半開羊肚菌類。目前我國可以人工栽培的羊肚菌基本均屬于黑色羊肚菌類，例如尖頂羊肚菌、羊肚菌[5，6]等。杜習慧等研究表明，由于環境和氣候等外界條件的變化會導致羊肚菌子囊果的形狀、大小、顏色的改變，甚至同一物種不同發育階段，其形態特征都有較大變化，例如梯紋羊肚菌不同發育階段的形態存在較大差異[7]。加之不同環境條件下，水分、空氣濕度、光線強弱等均會對羊肚菌的形態產生不同的影響，造成同一品種菇形差異較大。因此僅從形態特征上難以準確鑒定羊肚菌的種類，還需以分子標記加以輔助。Du通過對我國羊肚菌系統發育研究，發現中國有30種羊肚菌，其中有20個為本地種，9個種在歐洲也有分布，4個種可能是火燒適應種[8]。王波和鮮靈對四川地區人工栽培的羊肚菌進行了形態特征描述和ITS rDNA序列分析，表明該地人工栽培羊肚菌均為梯紋羊肚菌（Morchella importuna）[9]。

筆者對北京地區栽培的羊肚菌進行了采集和分析，以期確定北京栽培羊肚菌的種類。

1 材料與方法

1.1 菌株分離、培養與保存

羊肚菌新鮮子實體分別采集自北京懷柔、昌平等地人工栽培的新鮮菌子囊果，商品菌株編號分別為2022、黑脈、羊朱164。菌株純培養的分離采用組織分離法，三個商品菌株分別對應YD1701、YD1702和YD1703。菌株于25℃培養，4℃保存。

1.2 形態特征鑒定方法

對羊肚菌子實體進行了子實體的外觀形態和顯微形態特征觀察，記錄形態特征。

1.3 基于ITS序列分析的分類學鑒定

1.3.1 基因組DNA提取方法

圖1 人工栽培的3個品種羊肚菌子囊果的形態特征（從左至右為羊朱164、2022、黑脈羊肚菌）

以PDA平板上生長的新鮮菌絲體為材料，無菌條件下刮取，以DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取基因組DNA。

1.3.2 ITS序列分析

ITS部分序列PCR擴增以真菌ITS通用引物ITS1和 ITS4，PCR 反應體系 50 μL。反應體系為50 μL，該體系包括2×PCR Master Mix 25 μL，Primer（0.2 μmol/L）各1.5 μL；模板DNA 1 μL，加ddH2O 補齊至50 μL。在BioRad My Cycle型PCR儀上擴增，PCR程序設定 94℃，3 min（預變性）；94℃變性1 min，54℃下退火1 min72℃，延伸2 min；共計30個循環；循環結束后在72℃延伸8 min。

1.3.3 測序

將ITS-PCR產物進行純化，操作方法依試劑盒的操作手冊進行，純化后的PCR擴增產物和引物直接測序，測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.3.4 ITS序列分析

測序結果利用BLAST在線比對工具進行序列分析，并根據文獻報道，從GenBank數據庫中下載羊肚菌屬多個種的ITS序列，使用Mega 6.0軟件中NJ法構建系統發育關系樹，分析同源關系，分析分類學地位。

2 結果與分析

2.1 子實體形態特征

對采集自北京懷柔區和昌平區的人工栽培的羊肚菌進行了形態特征描述，采集的3個羊肚菌樣品在子實體形態特征上無明顯區別（圖1）。羊肚菌子實體菌蓋為灰黑色、錐形，縱棱排列較規則，橫棱不規則，縱棱和橫棱交接形成似梯子狀的橫隔，凹坑深。菌蓋長8～10 cm，直徑2.3～2.8 cm；菌蓋與菌柄離生，菌蓋中空，菌柄柱狀，基部稍膨大，中空，白色；菌柄長度3.5～4.0 cm，直徑1.0～1.3 cm。子囊棒狀，無色，每個子囊內有8個子囊孢子，縱向或重疊排列，大小為（160～200）μm×（16～20）μm；側絲棒狀，頂端膨大，大小為（80～110）μm×（7～10）μm；子囊孢子橢圓形，無色，大小為（10～16）μm×（7～12）μm。

2.2 ITS擴增

對3個羊肚菌種樣品進行基因組DNA提取后，通過ITS1、ITS4引物進行PCR擴增，擴增產物進行電泳檢驗，產物測序獲得YD1701、YD1702和YD1703菌株部分ITS序列，長度分別為720 bp、717 bp和716 bp。

2.3 羊肚菌屬的系統發育分析

采用Neighbor-Joining法構建3個羊肚菌和GenBank中下載的21個羊肚菌屬種的基于ITS系列的系統發育樹狀圖（圖2）。待鑒定的羊肚菌3個樣品與Morchella importuna在同一個分枝上，其序列系相似性為99%，除Morchella sextelata外，與其它羊肚菌屬的6個種在不同分枝上。當序列相似性≥99%時，為相同物種，因此，待鑒定的3個人工栽培羊肚菌應為梯紋羊肚菌Morchella importuna。

圖2 3個羊肚菌樣品的ITS電泳圖譜

3 討論與結論

圖3 基于羊肚菌ITS rDNA序列的NJ系統發育樹

近幾年，羊肚菌人工栽培已取得成功，并且在四川、重慶、湖北等地大面積栽培。2016年全國人工栽培羊肚菌突破1533.3 hm2，發展較為迅猛。由于早期缺乏分子標記的證據，不同條件下人工栽培的羊肚菌子囊果個體間差異較大，難以根據系統特性加以鑒定，最早利用仿生栽培的羊肚菌被認為是尖頂羊肚菌[5，10]。筆者將北京大面積栽培的羊肚菌ITS rDNA序列與GenBank中羊肚菌序列進行分析，發現北京人工栽培的羊肚菌為梯紋羊肚菌M.importuna。這與王波、杜習慧的報道一致[7，9]。而何培新等的研究表明，目前我國大面積種植的羊肚菌分別為梯紋羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌[11]。

北京人工栽培的羊肚菌物種鑒定為梯紋羊肚菌，可能由于引種的原因，來源于四川，也可能由本地的野生羊肚菌馴化而來。目前，可以栽培的羊肚菌并不局限于梯紋羊肚菌。如在美國分布并實現人工栽培的變紅羊肚菌M.rufobrunnea。在我國云南等地尖頂羊肚菌也被用于仿生栽培獲得，但未見按照大田栽培模式的報道。因此，科研人員可以擴大羊肚菌種質資源的收集，加大野生羊肚菌的馴化栽培，或許可以篩選出可栽培的羊肚菌新種類。

研究結果表明，相對于其他主產區，北京地區目前大面積栽培的羊肚菌種類比較單一，為梯紋羊肚菌M.importuna。