茶樹菇富硒液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

趙金鳳 劉朝貴

（1重慶市渝北區(qū)經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)推廣站，重慶渝北401120；2西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶渝北401120）

茶樹菇（Agrocybe cylindracea），隸屬真菌門（Eumycophyta），擔(dān)子菌綱（Basidomycetes），糞銹傘科（Bolbitiaceae），田菇屬（Agrocybe），又名柱狀田頭菇，楊樹菇，茶薪菇等[1]。目前對(duì)茶樹菇的研究主要集中在液體發(fā)酵條件、培養(yǎng)基的篩選和其生物活性上。試驗(yàn)以茶樹菇為載體，研究了其富硒液體發(fā)酵培養(yǎng)條件，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

茶樹菇菌株由西南大學(xué)蔬菜實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基[2]。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)基

葡萄糖 20 g，蛋白胨 4 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB10.01 g，加水1 L，pH自然。

1.2.3 基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基

葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，Na2SeO35 mg，VB10.01 g，水1 L，pH自然。

1.2.3.1 碳源單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基

將基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基里的碳源替換為葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖。

1.2.3.2 氮源單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基

將基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基里的氮源替換為牛肉膏、黃豆粉、酵母膏、氯化銨、蛋白胨。

1.2.3.3 pH單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基

將基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基的pH設(shè)定為5、6、7、8。

1.2.3.4 維生素單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基

將基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基里的維生素替換為VB1、VB2、VB6

1.2.3.5 液體發(fā)酵正交設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以菌絲生物量（干）（后文菌絲生物量均指干重）、硒含量、富硒率和胞內(nèi)硒多糖的產(chǎn)量為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)碳源（A）、氮源（B）、pH（C）、維生素（D）4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。富硒液體發(fā)酵的正交試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 富硒液體發(fā)酵的正交試驗(yàn)

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 母種活化培養(yǎng)

將茶樹菇接種于基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基上，（25±1）℃恒溫培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)滿平板表面后待用。

1.3.2 種子培養(yǎng)基制作

取直徑8 mm的活化茶樹菇平板菌種8塊接入裝有100 mL已滅菌的液體種子培養(yǎng)基中，于25℃、120 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)10 d，得一級(jí)液體菌種。

1.3.3 菌絲培養(yǎng)

以10%的接種量將一級(jí)液體菌種接入裝有100 mL已滅菌的二級(jí)液體培養(yǎng)基中，于25℃、120 r/min，轉(zhuǎn)速恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基設(shè)3個(gè)重復(fù)。8 d后測(cè)定不同碳源、氮源、pH、維生素條件下菌絲生物量、硒含量和富硒率。

1.3.4 觀察測(cè)定方法

1.3.4.1 茶樹菇菌絲體生物量測(cè)定，參照參考文獻(xiàn)[3]。

1.3.4.2 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

參照參考文獻(xiàn)[4]。

1.3.4.3 有機(jī)硒含量測(cè)定

總硒含量測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[3]。樣品不經(jīng)消化處理，按上述測(cè)定總硒的方法測(cè)定無(wú)機(jī)硒含量。有機(jī)硒含量=總硒含量-無(wú)機(jī)硒含量。

富硒率計(jì)算方法：

2 結(jié)果與分析

2.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照方法1.4.2，繪制了硒標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)硒溶液的濃度（x，μg/mL）和吸光度（y）在0～30 μg/L成線性關(guān)系。回歸方程為：y=0.010x+0.008，R2=0.997。

圖1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 富硒茶樹菇液體培養(yǎng)基的篩選

2.2.1 不同碳源對(duì)茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

在碳源單因素試驗(yàn)中采用了5種不同的碳源（葡萄糖、淀粉、乳糖、蔗糖和麥芽糖）作為茶樹菇液體富硒的碳源，研究這幾種碳源對(duì)茶樹菇菌絲干生物量、硒含量及富硒率的影響。由表3可以看出，這五種碳源茶樹菇都能利用，從菌絲生物量、硒含量及富硒率方面看，都以葡萄糖為最好。當(dāng)葡萄糖作為碳源時(shí)，菌絲生物量達(dá)0.29 g/50 mL，硒含量達(dá)49.5 μg/g，富硒率達(dá)5.81%。這與單糖更容易吸收，更有利于菌絲體生長(zhǎng)的報(bào)道一致[6]。通過(guò)最小顯著性檢驗(yàn)（LSD）的結(jié)果可知，葡萄糖為碳源的菌絲生物量達(dá)到極顯著性水平，富硒率和乳糖差異不顯著。這五種碳源對(duì)含硒量的影響都不顯著。從菌絲生物量、有機(jī)硒及富硒率三方面考慮，選用葡萄糖、麥芽糖、乳糖作為茶樹菇富硒正交試驗(yàn)的碳源。

2.2.2 不同氮源對(duì)茶樹菇菌絲干生物量、硒含量及富硒率的影響

在氮源單因素試驗(yàn)中也采用了5種不同的氮源（牛肉膏、黃豆粉、酵母膏、氯化銨、蛋白胨）作為茶樹菇液體富硒培養(yǎng)的氮源，研究這幾種氮源對(duì)茶樹菇菌絲生物量、有機(jī)硒及富硒率的影響。從表4可以看出，不同的氮源對(duì)茶樹菇菌絲生長(zhǎng)有不同程度的作用，就菌絲生物量而言，有機(jī)氮的利用較無(wú)機(jī)氮好，這是因?yàn)槭秤镁芾糜袡C(jī)氮而不能利用無(wú)機(jī)氮。就含硒量而言氯化銨最好，這可能是因?yàn)榫z生長(zhǎng)緩慢在搖瓶過(guò)程中不斷吸附亞硒酸鈉，形成硒絡(luò)合物，從而轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒。富硒率則以牛肉膏、黃豆粉、蛋白胨最好，與酵母膏和氯化銨差異顯著。從菌絲生物量、有機(jī)硒及富硒率三方面考慮，選用肉膏、黃豆粉和蛋白胨作為茶樹菇富硒正交試驗(yàn)的氮源。

2.2.3 不同pH對(duì)茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

pH的大小會(huì)影響食用菌菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中酶的活性，pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)某些酶的活性起到抑制作用，從而使菌絲的代謝減緩，影響菌絲生長(zhǎng)。一般認(rèn)為pH對(duì)酶活性的影響是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)H+或OH-影響酶蛋白的電荷及解離度，而改變酶的結(jié)構(gòu)和功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由表5可以看出，當(dāng)pH為7時(shí)，菌絲生物量達(dá)到0.38 g/50 mL，與pH為5、6、8相比，菌絲生物量差異達(dá)到顯著水平。當(dāng)pH為5、8時(shí)，與pH為6、7相比，硒含量達(dá)到顯著水平。pH為7、8時(shí)，與pH為5、6相比，富硒率達(dá)到極顯著水平。綜合菌絲生物量、有機(jī)硒及富硒率三方面考慮，試驗(yàn)選用pH為5、7、8作為茶樹菇富硒正交試驗(yàn)的pH。

表3 不同碳源對(duì)茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

表4 不同氮源對(duì)茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

表5 不同pH對(duì)茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

表6 不同維生素對(duì)茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

2.2.4 不同維生素對(duì)茶樹菇菌絲生物量、硒含量及富硒率的影響

采用了三種不同的維生素，且每種維生素設(shè)了兩個(gè)不同的質(zhì)量。從表6可以看出，維生素對(duì)菌絲生物量的影響較小，菌絲生物量之間沒(méi)有顯著性差異。維生素對(duì)硒含量的影響較大，當(dāng)VB1為0.01 g時(shí)，硒含量達(dá)到49.50 μg/g，富硒率達(dá)到5.81%，硒含量和富硒率都達(dá)到極顯著水平。綜合菌絲生物量、有機(jī)硒及富硒率三方面考慮，試驗(yàn)選用VB10.01 g、VB10.005 g、VB20.005 g作為茶樹菇富硒正交試驗(yàn)的維生素。

2.2.5 茶樹菇富硒液體發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

單因素試驗(yàn)初步篩選了適合茶樹菇菌絲生長(zhǎng)，具有較高硒含量和富硒率的較佳因子，為了考察這些因子的協(xié)同作用，按表1進(jìn)行了正交試驗(yàn)，結(jié)果如表7所示。根據(jù)表7的極差分析比較，4種因素對(duì)茶樹菇菌絲生物量影響大小依次為A＞B＞D＞C，碳源對(duì)菌絲生物量的影響最大。4種因素對(duì)茶樹菇菌絲硒含量影響大小依次為B＞D＞A＞C，氮源對(duì)菌絲干生物量的影響最大。4種因素對(duì)茶樹菇菌絲富硒率影響大小依次為A＞B＞D＞C，碳源對(duì)菌絲生物量的影響最大。綜合考慮菌絲生物量、有機(jī)硒及富硒率，實(shí)際最優(yōu)處理為：A3B3C2D1。由于三個(gè)指標(biāo)的最優(yōu)水平組合不一致，根據(jù)三個(gè)指標(biāo)的主次關(guān)系，硒含量和富硒率才是試驗(yàn)最重要的指標(biāo)，所以根據(jù)硒含量和富硒率極差優(yōu)水平組合，提出預(yù)測(cè)優(yōu)處理為：A3B3C1D1，按此組合進(jìn)行最優(yōu)驗(yàn)證試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果：茶樹菇菌絲生物量為 0.23 g/50 mL，硒含量為58 μg/g，富硒率為5.34%。因此可以確定茶樹菇富硒液體發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基為：乳糖 20 g，蛋白胨 2 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB10.01 g，pH5，水1 L。

表7 富硒液體發(fā)酵的正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析

3 小結(jié)

通過(guò)單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)篩選了茶樹菇富硒及產(chǎn)胞內(nèi)硒多糖的最佳培養(yǎng)基。但是本試驗(yàn)僅對(duì)液體發(fā)酵的碳源、氮源、pH和維生素進(jìn)行了篩選，沒(méi)有對(duì)碳氮比、無(wú)機(jī)鹽等進(jìn)行優(yōu)化，這些問(wèn)題還有待于進(jìn)一步研究。