真姬菇不同生長時期胞外酶活性變化研究

宋利茹 竇宏強(qiáng) 席亞麗 梁倩倩 魏生龍 *

（1河西學(xué)院廳市共建甘肅省食用菌遺傳育種重點實驗室，甘肅張掖734000；2河西學(xué)院甘肅省應(yīng)用真菌工程實驗室，甘肅張掖734000）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）又名斑玉蕈、蟹味菇、玉蕈、海鮮菇等[1]隸屬真菌界（Fungi），擔(dān)子菌門（Basidiomycota），傘菌綱（Agaricomycetes），傘菌目（Agaricales），離褶傘科，玉蕈屬（Hpysizygus），是北溫帶一種珍稀藥食兩用菌[2]。

真姬菇雖然已成為我國商品化栽培的品種之一，但由于其在栽培過程中的生產(chǎn)周期較長（120～140 d）[3]，限制了真姬菇工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)度，同時也導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高。在食用菌生長發(fā)育過程中，胞外酶將培養(yǎng)料的大分子裂解成能使菌絲和子實體利用的小分子物質(zhì)，從而為食用菌的生長發(fā)育提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，胞外酶在食用菌的整個生長發(fā)育過程都起著非常重要的作用[4-5]。筆者對真姬菇在菌絲長至菌袋的1/4、菌袋1/2等共8個生長發(fā)育時期的胞外酶活性進(jìn)行測定，以期找出真姬菇在不同生長發(fā)育時期胞外酶活性變化規(guī)律，為揭示真姬菇基質(zhì)利用機(jī)理提供理論參考，從而為工廠化生產(chǎn)縮短真姬菇生長周期提供借鑒。現(xiàn)將試驗結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

采用真姬菇3001，由甘肅省應(yīng)用真菌工程實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基參照參考文獻(xiàn)[6]的方法制備。

1.3 儀器設(shè)備

不銹鋼立式壓力滅菌鍋；恒溫?fù)u床THZ-92A，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；電子天平，BS223S，Sartorius；生化培養(yǎng)箱；超凈工作臺SW-CJ-IFD，蘇州凈化設(shè)備有限公司；電磁爐。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化

從冰箱中取出供試菌株，在無菌條件下，接種于75 mL的PDA平板中央，封口，25℃恒溫培養(yǎng)備用[6]。

1.4.2 拌料及裝袋滅菌

真姬菇栽培料配方為：棉籽殼49%，木屑30%，麩皮15%，玉米面5%，石膏粉1%。選用17 cm×33 cm的聚丙烯塑料袋裝料，每袋裝濕料0.6 kg，于121℃下高壓滅菌2 h，于冷卻室冷卻，待料溫低于25℃后于無菌條件下接種，接種后將栽培袋移入培養(yǎng)室中。培養(yǎng)條件為溫度25℃，空氣相對濕度65%～75%，出菇條件為溫度15℃，空氣相對濕度95%，光照400 lx。

1.4.3 樣品采集

觀察記錄真姬菇生長發(fā)育，于以下8個不同生長發(fā)育時期進(jìn)行取樣：①菌絲長至菌袋的1/4，②菌絲長至菌袋1/2，③菌絲長至菌袋3/4，④菌絲滿袋，⑤原基形成，⑥原基形成后7 d，⑦子實體成熟，⑧子實體采后3 d。隨機(jī)選取各生長階段菌袋3袋，每袋取樣20 g，混勻，備用。

1.4.4 酶液制備

粗酶液提取參照參考文獻(xiàn)[7]的方法。取混勻后的樣品5 g加入20 mL去離子雙蒸水，40℃浸提2 h，過濾、定容至 25 mL，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清（上清液即為粗酶液），低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 各種酶活性測定

羧甲基纖維素酶活性測定參照參考文獻(xiàn)[8]；濾紙纖維素酶活性測定參照參考文獻(xiàn)[8]；淀粉酶活性測定參照參考文獻(xiàn)[9]；漆酶活性測定參照參考文獻(xiàn)[10]；β-葡萄糖苷酶活性測定參照參考文獻(xiàn)[9]；愈創(chuàng)木酚酶活性測定參照參考文獻(xiàn)[11]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計、作圖，用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)素降解酶

2.1.1 漆酶活性變化

由圖1可以看出真姬菇在原基形成和子實體采后3 d時漆酶活性最高，且極顯著高于其它各生長發(fā)育時期。

2.1.2 愈創(chuàng)木酚酶活性變化

愈創(chuàng)木酚酶同漆酶一樣可以衡量真姬菇對木質(zhì)素的降解能力。由圖2可以看出，愈創(chuàng)木酚酶活性在成熟期以前沒有顯著性差異；在采后3 d愈創(chuàng)木酚酶活性達(dá)到最大值。愈創(chuàng)木酚酶在生殖生長階段活性顯著高于營養(yǎng)生長階段，說明真姬菇對木質(zhì)素的利用主要集中在子實體生長階段。

2.2 纖維素降解酶

2.2.1 羧甲基纖維素酶活性變化

從圖3可以看出，供試菌株第8個生長階段即子實體采后3 d纖維素酶活性最高，可達(dá)到14.36 U，且顯著高于其它生長發(fā)育時期；其次子實體成熟期纖維素酶活性也顯著高于其它時期；而其中以原基形成后7 d的纖維素酶活性最低。表明真姬菇在子實體成熟和采后3 d出現(xiàn)了較高纖維素酶活性。纖維素酶與真姬菇子實體生長發(fā)育相關(guān)，但在真姬菇子實體形成階段纖維素酶活性均較低，可能導(dǎo)致真姬菇對栽培基質(zhì)的利用率不高。

2.2.2 濾紙纖維素酶活性變化

由圖4可以看出，真姬菇在菌絲長至菌袋1/4時濾紙纖維素酶活性最高為3.62 U，且隨著生長發(fā)育濾紙纖維素酶活性降低，在菌絲長至菌袋1/2及原基形成后7 d時最低，并且極顯著低于其它各生長發(fā)育時期。

圖1 漆酶活性

圖2 愈創(chuàng)木酚酶活性

圖3 羧甲基纖維素酶活性

圖4 濾紙纖維素酶活性

圖5 β-葡萄糖苷酶活性

圖6 淀粉酶活性

2.2.3 β-葡萄糖苷酶活性變化

由圖5可以看出，在真姬菇整個生長階段，β-葡萄糖苷酶呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。并且在原基形成階段達(dá)到最高值為14.2 U，且極顯著高于其它生長發(fā)育時期；而以菌絲長至菌袋3/4時最低。

2.3 淀粉酶活性變化

由圖6看出，隨著真姬菇生長發(fā)育淀粉酶活性升高，且在子實體采后3 d纖維素酶活性最高，可達(dá)到5.87 U，但與子實體成熟期差異不顯著，與其它發(fā)育階段差異極顯著。淀粉酶活性以菌絲長至菌袋1/2最低為0.584 U。

3 小結(jié)與討論

胞外酶活性的變化反映食用菌對培養(yǎng)料利用情況，一直以來都是研究的熱點。

試驗結(jié)果表明，濾紙纖維素酶在菌絲長至菌袋1/4時活性最高，這可能與濾紙纖維素酶是最初對纖維素起作用的酶有關(guān)，而β-葡萄糖苷酶在營養(yǎng)生長階段呈逐漸上升的趨勢，且在原基形成期達(dá)到最大值，隨后逐漸下降；羧甲基纖維素酶呈逐漸上升的趨勢，且在采后3 d達(dá)到最大值，這三種酶的峰值交替出現(xiàn)，可能與纖維素在基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)形式有關(guān)，同時也說明這三種酶分別在真姬菇不同生長發(fā)育時期起關(guān)鍵作用。

試驗表明，漆酶的活性遠(yuǎn)高于愈創(chuàng)木酚酶的活性，說明漆酶在真姬菇降解木質(zhì)素過程中起主要作用。漆酶和愈創(chuàng)木酚酶均在采收后期出現(xiàn)峰值，說明在這一過程中大量木質(zhì)素被降解，使得纖維素被暴露，這也可能與羧甲基纖維素酶在采后后期出現(xiàn)峰值有關(guān)。漆酶活性在采后3 d與原基形成期差異不顯著，說明漆酶與真姬菇的原基形成有關(guān)，這一結(jié)果與袁勝東等[8]的研究結(jié)果一致，在猴頭菇、虎皮香菇[13]、白靈菇[14]及香菇[15]等的研究中也發(fā)現(xiàn)在原基形成期漆酶活性達(dá)到最大值，但關(guān)于漆酶與原基形成的機(jī)理尚不清楚，可以作為今后研究方向。試驗發(fā)現(xiàn)除了漆酶在原基形成期有最高活性外，β-葡萄糖苷酶在原基形成期也達(dá)到最高值，但β-葡萄糖苷酶是否與原基形成有關(guān)還需進(jìn)一步驗證。

淀粉酶的活性也隨著真姬菇生長發(fā)育呈增加趨勢，且在成熟期及采后3 d達(dá)到最高值，說明淀粉酶可能與子實體成熟密切相關(guān)，因此，可以在真姬菇的栽培基質(zhì)中適當(dāng)加入淀粉類物質(zhì)，可能有助于提高真姬菇的產(chǎn)量。

綜上所述，真姬菇培養(yǎng)料中降解木質(zhì)素的漆酶和愈創(chuàng)木酚酶在菌絲生長階段活性均較低，可能導(dǎo)致木質(zhì)素降解緩慢，而木質(zhì)素又是纖維素和半纖維素被降解的前提，因此，真姬菇菌絲生長階段由于養(yǎng)分供應(yīng)不充足而生長緩慢，這也可能是真姬菇生長周期較長的主要原因。可以考慮繼續(xù)優(yōu)化真姬菇栽培料配方，以期找到能縮短栽培周期的最優(yōu)配方。其次，漆酶可能與真姬菇原基形成有關(guān)，可以考慮通過調(diào)控漆酶的活性使真姬菇較早由生殖生長期轉(zhuǎn)入營養(yǎng)生長期，以縮短栽培周期。