分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于野生動(dòng)物保護(hù)及擴(kuò)散研究概況

劉 旭 丁由中

(1.國家海洋局海島研究中心，平潭，350400；2.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海，200062)

由于人類的亂捕濫獵和環(huán)境的不斷惡化，許多動(dòng)物瀕臨滅絕境地，人們迫切要求了解這些動(dòng)物的生存狀況，從而采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)和管理措施。近年來，瀕危野生動(dòng)物的保護(hù)主要集中在遺傳多樣性方面的保護(hù)，微衛(wèi)星技術(shù)正是遺傳多樣性研究的重要手段之一。隨著微衛(wèi)星等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者可以通過一些分子標(biāo)記來研究種群的擴(kuò)散模式，從而可以更加有效地保護(hù)和管理野生動(dòng)物[1]。

1 糞便分子生物學(xué)

1.1 糞便分子生物學(xué)在瀕危物種保護(hù)中的應(yīng)用

糞便分子生物學(xué)技術(shù)就是從動(dòng)物糞便中提取動(dòng)物基因組DNA，然后借助PCR技術(shù)和多種分子標(biāo)記，從而對(duì)動(dòng)物進(jìn)行遺傳分析的研究[2]。瀕危野生動(dòng)物的保護(hù)目前主要集中在遺傳多樣性方面的保護(hù)。而要獲取動(dòng)物的遺傳信息，必須采集含有遺傳物質(zhì)的樣品進(jìn)行分析。在20世紀(jì)六七十年代，通常采用損傷性取樣法，如殺死研究對(duì)象以獲得新鮮樣品，由于這種取樣方法常常對(duì)動(dòng)物資源造成極大破壞，其應(yīng)用范圍受到很大限制。以糞便學(xué)為基礎(chǔ)的糞便取樣分析方法，在很大程度上解決了這一問題。而且糞便的采集要比血液和組織的采集更容易、更方便，一般不會(huì)對(duì)瀕危動(dòng)物的身體和生活造成任何不利影響，這對(duì)瀕危動(dòng)物的保護(hù)有十分重要的實(shí)際意義。

1.2 糞便作為分子生物學(xué)研究材料的可行性

糞便的主要成分是未消化的食物殘?jiān)@些食物殘?jiān)谕ㄟ^腸道時(shí)經(jīng)常會(huì)夾雜有大量的脫落的腸道上皮細(xì)胞。據(jù)研究報(bào)道，每個(gè)人每克新鮮糞便中就含有100 000個(gè)腸道上皮細(xì)胞[3]，而且大部分是活細(xì)胞，這就意味著研究者可以從糞便中獲取糞便產(chǎn)生者的DNA進(jìn)行遺傳分析，也就是說它具備核DNA的所有標(biāo)記，例如RFLP、RAPD和AFLP，以及微衛(wèi)星標(biāo)記等，這對(duì)于瀕危野生動(dòng)物的遺傳學(xué)研究有非常重要的意義；另外，在野外自然條件下采集的新鮮糞便在酒精中保存半年以后仍能成功地提取出DNA，而且發(fā)現(xiàn)在干燥或冷凍的條件下也能很好地保存糞便樣品[4]，這說明野生瀕危動(dòng)物的糞便采樣及保存是十分可行的。相關(guān)的實(shí)驗(yàn)已有報(bào)道，如Reed等利用微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)82個(gè)海豹(Phocidae)糞便樣品成功地進(jìn)行了個(gè)體識(shí)別和種群大小的估計(jì)，同時(shí)他們還利用性染色體上的SRY-Y53-3C，SRY-Y53-3D引物對(duì)海豹糞便DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果從40個(gè)海豹糞便樣品檢測(cè)到1例雄性個(gè)體[5]。在國內(nèi)方盛國等通過對(duì)大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)的糞便DNA的提取，同時(shí)借助限制性酶切、分子雜交、同位素標(biāo)記等技術(shù)成功地構(gòu)建了大熊貓指紋圖譜[6-7]。由此可見，糞便分子生物學(xué)方法正在成為野生動(dòng)物遺傳學(xué)分析的重要工具。

2 微衛(wèi)星DNA

微衛(wèi)星DNA也被稱為數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)、短串聯(lián)重復(fù)、簡單序列重復(fù)和簡單序列長度多態(tài)，是指以1—6個(gè)核苷酸為基本重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)序列[8]。它們廣泛存在于各類真核生物基因組中，原核生物基因組中也含有少量的微衛(wèi)星序列。微衛(wèi)星序列具有種類多、分布廣泛、高度多態(tài)性、雜合性高、重組率低的特點(diǎn)，在群體中變易范圍大，構(gòu)成了豐富的長度多態(tài)性，有高度的個(gè)體特異性，并遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律，是近年來飛速發(fā)展起來的一類新型的DNA高度多態(tài)性遺傳標(biāo)記系統(tǒng)。目前，微衛(wèi)星技術(shù)已廣泛應(yīng)用于高分辨率的遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，對(duì)人類疾病的診斷和鑒別、群體遺傳研究、法醫(yī)上的人身鑒定以及親屬血緣關(guān)系鑒定等[9]。

2.1 微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的獲得

為了從微衛(wèi)星DNA中得到有效的生物學(xué)信息，微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的獲得是微衛(wèi)星分析的關(guān)鍵。目前獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)的途徑主要有兩種：一是基于微衛(wèi)星DNA文庫克隆所需要的微衛(wèi)星位點(diǎn)。這種方法包括構(gòu)建DNA文庫、篩選克隆片段、測(cè)序和根據(jù)序列設(shè)計(jì)PCR的引物以進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增。這種方法可以一次性獲得成百上千個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，其缺點(diǎn)是操作煩瑣，工作量大，且耗資巨大。二是利用已發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星位點(diǎn)尋找新的位點(diǎn)。Moore等發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物基因組中的保守微衛(wèi)星位點(diǎn)[10]。Engel等發(fā)現(xiàn)，為某一種偶蹄目(Artiodactyla)動(dòng)物設(shè)計(jì)的引物，也可以擴(kuò)增出其他偶蹄目動(dòng)物的微衛(wèi)星。例如，他們用牛、山羊和綿羊的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的PCR產(chǎn)物，從旋角羚(Addaxnasomuculatus)等16種?？?Bovidae)動(dòng)物的345個(gè)組織凍存樣中，成功擴(kuò)增了微衛(wèi)星多態(tài)產(chǎn)物。其他一些研究也證實(shí)，對(duì)于同屬、科、目中的不同物種也可以使用異種引物擴(kuò)增微衛(wèi)星，從而大大推動(dòng)了微衛(wèi)星分析的應(yīng)用[11]。

2.2 微衛(wèi)星的應(yīng)用

2.2.1 個(gè)體識(shí)別

個(gè)體識(shí)別需要大量的分子標(biāo)記，其中微衛(wèi)星標(biāo)記是目前應(yīng)用的最為廣泛的，因?yàn)槲⑿l(wèi)星符合孟德爾遺傳，而且在個(gè)體間呈現(xiàn)出較高的多態(tài)性，因此常用來進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。

2.2.2 性別鑒定

瀕危動(dòng)物性別的鑒定也是估計(jì)該瀕危動(dòng)物生存力的一個(gè)重要指標(biāo)。如果雌雄性比嚴(yán)重失衡，終將影響該瀕危動(dòng)物的繁殖力，抑或造成嚴(yán)重的近交衰退，繼而影響其種群的生存力。Wasser等利用糞便中提取的DNA，通過引物ZFY/X-P1-5EZ，ZFY/X-P1-3EZ，SRY-Y53-3C，SRY-Y53-3D等4對(duì)引物成功地鑒定出2只馬來熊(Helarctosmalayanus)的性別為一雌一雄[4]。

2.2.3 親子鑒定

親子鑒定所采用的分子標(biāo)記種類繁多，如同工酶、AFLP、DNA指紋、微衛(wèi)星等[12]。其中，微衛(wèi)星標(biāo)記則因其共顯性、高度多態(tài)性、模板量要求低和應(yīng)用方便等優(yōu)勢(shì)，成為了相關(guān)領(lǐng)域首選[13]。而親子鑒定所采用的數(shù)理方法則主要有3種[14]：排除法、似然法和基因型重建法。其中排除法根據(jù)孟德爾遺傳定律檢測(cè)母親與可疑父本基因型組合能否產(chǎn)生子代基因型，若不能則排除相應(yīng)可疑父本。似然法則是根據(jù)等位基因頻率計(jì)算各非排除父本為親生父本的概率從而確定最大可能父本。而基因型重建較多用于多父本現(xiàn)象存在的物種的種群結(jié)構(gòu)分析中[15]。張于光對(duì)東北虎(Pantheratigrisaltaica)微衛(wèi)星DNA遺傳標(biāo)記引物進(jìn)行了篩選，并利用篩選出的引物成功地對(duì)7對(duì)父子關(guān)系不明的東北虎進(jìn)行了鑒定，為東北虎后代繁殖措施的制定提供了有利的依據(jù)[16]。張亞平等用微衛(wèi)星DNA進(jìn)行圈養(yǎng)大熊貓的親子鑒定，發(fā)現(xiàn)在一雌多雄交配過程中，只有個(gè)別雄性個(gè)體是有效的。該研究還結(jié)合基因型的鑒定，制定了繁殖計(jì)劃，防止圈養(yǎng)大熊貓出現(xiàn)近交衰退現(xiàn)象[17]。

2.2.4 家域分析

家域(home range)是動(dòng)物進(jìn)行取食、交配、育幼等日?；顒?dòng)的區(qū)域，對(duì)于動(dòng)物的生存和繁衍、保育和再引種具有重要意義[18-20]。國內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者關(guān)于有蹄類家域的估算方法多采用最小凸多邊形法(minimum convex polygon，MCP)和內(nèi)核法(kernel)，基于微衛(wèi)星技術(shù)用于物種家域的研究相對(duì)較少。Taberlet等通過遺傳學(xué)方法獲得的比利牛斯山脈棕熊(Ursusarctospyrenaicus)的家域數(shù)據(jù)與歐洲和北美洲利用無線電跟蹤技術(shù)研究的結(jié)果一致[21]。Kohn等描述了家域的使用、父權(quán)鑒定和親緣關(guān)系鑒定都能用糞便基因型的分布和關(guān)系模式來推斷[22]。Smith等應(yīng)用遺傳學(xué)和GIS兩種方法評(píng)價(jià)了胡安捷狐(Vulpesmacrotismutica)糞便微衛(wèi)星DNA結(jié)果可靠度的可行性和應(yīng)用性[23]。

3 擴(kuò)散生態(tài)學(xué)研究

擴(kuò)散是指?jìng)€(gè)體離開現(xiàn)有的種群或父母種群的行為[24]。擴(kuò)散所帶來的后果不僅作用于個(gè)體適合度，而且影響種群動(dòng)態(tài)，種群遺傳多樣性和物種分布[25-26]。大量的研究把擴(kuò)散分為出生擴(kuò)散(natal dispersal)和繁殖擴(kuò)散(breeding dispersal)[27]。出生擴(kuò)散即個(gè)體在出生地或社群到繁殖地或繁殖社群之間的永久移動(dòng)，不管擴(kuò)散出去的個(gè)體繁殖與否；繁殖擴(kuò)散指繁殖個(gè)體在兩個(gè)連續(xù)的繁殖群和繁殖社群間移動(dòng)。擴(kuò)散會(huì)影響種群密度[28]；調(diào)節(jié)種群內(nèi)個(gè)體對(duì)資源和配偶的競(jìng)爭(zhēng)壓力；減小種群內(nèi)個(gè)體間近親繁殖的機(jī)會(huì)，避免近交衰退[29]；影響社群結(jié)構(gòu)和婚配系統(tǒng)[30]；還影響著種群的基因流動(dòng)，進(jìn)而影響種群的種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性[31-32]。

3.1 研究內(nèi)容及方法

早期人們使用環(huán)志和無線電遙測(cè)研究鳥類或獸類的遷移擴(kuò)散行為。但這些方法的共同弊端在于要捕獲動(dòng)物。有些動(dòng)物難于捕獲，捕獲后的重捕率低，這些都對(duì)擴(kuò)散的研究產(chǎn)生不利的影響。而且捕獲和標(biāo)記易對(duì)動(dòng)物造成損傷，甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡。近年來，隨著糞便分子生物學(xué)在生態(tài)學(xué)研究中的廣泛運(yùn)用，非損傷性取樣也成為研究擴(kuò)散模式的主要方式[33-34]。分子生物學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)不僅在于它能夠獲得大量樣本，以彌補(bǔ)直接方法在樣本量上的不足；更重要的是它能夠探討歷史上的擴(kuò)散活動(dòng)對(duì)當(dāng)代種群遺傳結(jié)構(gòu)的影響[35-36]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者可以通過同工酶、線粒體DNA、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA技術(shù)等一些分子標(biāo)記來研究種群的擴(kuò)散模式，從而在更大時(shí)間尺度上研究物種的擴(kuò)散[37-38]。分子生物學(xué)方法通過比較種群內(nèi)被捕獲個(gè)體和其他個(gè)體的遺傳相似度，并結(jié)合標(biāo)記重捕的數(shù)據(jù)對(duì)被捕獲個(gè)體是否從其他地方遷入做出推測(cè)，繼而研究擴(kuò)散模式[36，39-40]。

3.2 偏性擴(kuò)散

在主動(dòng)擴(kuò)散的鳥類和獸類中，擴(kuò)散往往存在著性別偏倚，即偏性擴(kuò)散[41]。了解為什么會(huì)發(fā)生偏性擴(kuò)散仍然是進(jìn)化生態(tài)學(xué)關(guān)心的重點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物中有偏雄性擴(kuò)散的趨勢(shì)，而在鳥類中偏雌擴(kuò)散占大多數(shù)。也有很多反例存在，比如大熊貓[34]、某些靈長類[33]中則為偏雌擴(kuò)散。在野外精確測(cè)量偏性擴(kuò)散仍然是一個(gè)問題，所以很多分子方面的技術(shù)及參數(shù)就被用來研究某個(gè)物種是否存在著偏性擴(kuò)散，如Goudet等利用共顯性遺傳標(biāo)記檢測(cè)偏性擴(kuò)散[42]。

種群內(nèi)個(gè)體間相互作用、近親繁殖的避免、配偶和資源競(jìng)爭(zhēng)、空間異質(zhì)性都是引導(dǎo)擴(kuò)散進(jìn)化的動(dòng)力。棲息地的異質(zhì)性、有限的資源和條件決定的擴(kuò)散都表明同種個(gè)體間、同性成員間，親緣間的競(jìng)爭(zhēng)在擴(kuò)散的進(jìn)化中充當(dāng)著重要的角色[27]。不同的棲息地質(zhì)量和社會(huì)結(jié)構(gòu)能使空間異質(zhì)性降低，棲息地的質(zhì)量不僅體現(xiàn)在資源水平方面，還體現(xiàn)在競(jìng)爭(zhēng)者的密度、寄生蟲和捕食者。在很多物種中，寄生蟲和捕食者的密度與擴(kuò)散相關(guān)。

4 結(jié)語

目前微衛(wèi)星技術(shù)在野生動(dòng)物的保護(hù)與管理中應(yīng)用的越來越多，也得到了一些傳統(tǒng)方法無法得到的研究成果，對(duì)于野生動(dòng)物的遺傳結(jié)構(gòu)分析、譜系圖譜構(gòu)建、系統(tǒng)分類等都起到了重要的作用，也對(duì)一些瀕危物種的遷徙擴(kuò)散行為進(jìn)行了一定的研究，但目前國內(nèi)微衛(wèi)星等分子生物學(xué)手段在珍稀瀕危動(dòng)物的遷徙擴(kuò)散研究還不是很多，今后若加強(qiáng)這方面的研究，必將對(duì)珍稀瀕危動(dòng)物的保護(hù)與管理提供更加可靠的參考依據(jù)。