組織腎素-血管緊張素系統、維生素D受體和Wnt/β-catenin在慢性病中交互作用的研究進展

李文雄，丁 凡，王擁軍,2，施 杞,2，張 巖,2

(1. 上海中醫藥大學附屬龍華醫院脊柱病研究所，上海 200032；2. 教育部筋骨理論與治法重點實驗室，上海 200032)

根據WHO的數據顯示，到2030年，心腦血管疾病、惡性腫瘤、糖尿病、慢性腎病等慢性非傳染性疾病(簡稱“慢性病”)將成為全球人口死亡的主要原因[1]。然而慢性病病因復雜，單一方面研究取得的成果有限。已知腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)的激活在慢性腎臟病和心血管疾病的發病機制中起著至關重要的作用。Wnt/β-catenin信號通路是一種進化保守的發育信號級聯，在調節器官發育和維持組織穩態中起著關鍵作用?；钚跃S生素D通過與維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)結合，除了維持血循環中鈣、磷水平穩定外，近來發現，其活性轉化酶CYP27B1在多個組織都有表達，并且維生素D對局部組織的生理調控也有重要作用。因此，Wnt/β-catenin信號通路、RAS和VDR均在多種慢性病中發揮著重要的調控作用。本文從Wnt/β-catenin信號通路、RAS和VDR 3者的關系出發，探究3者是否在慢性病的發生、發展中發揮協同或拮抗作用，以期為從多角度研究慢性病及創新藥物研發提供一定的理論支持。

1 Wnt/β-catenin、RAS和VDR

1.1 Wnt/β-catenin信號通路Wnt/β-catenin信號通路在調控胚胎發育、維持成體組織穩態、參與細胞增殖和分化等方面發揮著重要作用。沒有Wnt信號時，胞質內的β-連環蛋白(β-catenin)大部分與胞膜E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及α-連環蛋白(α-catenin)結合形成復合體，參與調節細胞骨架，維持同型細胞的黏附作用，防止細胞轉移。少部分β-catenin與軸蛋白(Axin)、結直腸腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli，APC)蛋白、酪蛋白激酶1(carsein kinase 1, CK1)、糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)形成降解復合物。降解復合物中的GSK-3β磷酸化β-catenin，進而被泛素連接酶β-TrCP(β-transducin repeats-containing proteins)蛋白識別而泛素化，維持胞質內游離β-catenin處于低水平狀態[2-3]。當有Wnt信號傳入時，Wnt蛋白與跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled, FZD)結合，在輔助受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6 (low density lipoprotein receptor related protein 5/6，LRP5/6)協同作用下，開啟Wnt/β-catenin信號通路的轉導，激活細胞內的CK1，CK1使Dsh/Dvl磷酸化，釋放GSK-3β結合蛋白(GBP)，抑制GSK-3β的磷酸激酶活性，使GSK-3β不能磷酸化β-catenin，β-catenin不被泛素識別，從而不被蛋白酶復合體降解，胞質中大量游離的β-catenin聚集，打破了出、入核平衡，β-catenin在核內聚集并結合T細胞因子(T cell factor, TCF)/淋巴樣增強因子(lymphoid enhancing factor，LEF)，激活下游靶基因，誘導細胞增殖[4]。

1.2 RASRAS是一種重要的激素內分泌系統，主要發揮調節血壓、水平衡、電解質穩態和心臟重塑等作用。在多種因素作用下，腎小球旁器分泌的腎素，并促使血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)生成血管緊張素Ⅰ (angiotensin Ⅰ，Ang Ⅰ)，Ang Ⅰ在血管緊張素轉化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)作用下，轉化成血管緊張素Ⅱ (angiotensin Ⅱ，AngⅡ)。 AngⅡ是RAS中重要的生物活性物質，主要通過與靶器官細胞膜上的特異性受體結合而發揮生理和病理效應。除了傳統循環中的RAS以外，多數組織也可通過自分泌、旁分泌或細胞內分泌等方式發揮局部作用。如在心臟、肝臟、胰腺、血管、腦、腎等許多組織中，AngⅡ可以不釋放到血液中而發揮局部作用。研究顯示，不僅局部組織產生RAS，細胞也存在自身的RAS，如心肌細胞、神經細胞、血管內皮細胞、肺泡上皮細胞等多種細胞中，均發現RAS成分[5-7]，說明RAS在細胞代謝與功能、組織器官中都具有重要的生物學作用。

1.3 VDRVDR是介導活性維生素D發揮生物效應的生物大分子，是存在于細胞質和細胞核中的核類固醇受體超家族的一員，主要分布在骨骼、腸道、腎臟等傳統靶器官上，心血管系統和中樞神經系統中也有一定VDR表達[8]。

VDR由膜受體(mVDR)和核受體(nVDR)兩大類組成。mVDR通過調節激酶和磷酸酶的活性，控制離子通道的開放狀態，發揮經典的鈣磷調節作用[9]。nVDR是核受體超家族中的一員，包括N端區、DNA結合區(DBD)和C端的配體結合區(LBD)。在N端區和LBD各有1個激活功能(activation function，AF)區。nVDR與活性維生素D結合后，構象發生變化，與維甲類X受體(retinoid X receptor，RXR)結合，構成異質二聚體并轉位到細胞核中，與目標基因啟動子區域中的維生素D反應元件(vitamin D response element，VDRE)結合，發揮基因調控效應，參與維生素D的非鈣磷調節作用[10]。

2 Wnt/β-catenin信號通路、RAS和VDR之間的交互作用

2.1 Wnt/β-catenin信號通路和RAS健康成人的Wnt/β-catenin信號處于沉默狀態，而在慢性病發生、發展過程中，Wnt/β-catenin信號被激活。已知RAS是引發慢性腎病、高血壓、冠心病等慢性病的一個重要因素，因此，Wnt/β-catenin和RAS可能在慢性病的發生、發展過程中存在著交聯與對話。

Zhao等[11]通過注射AngⅡ誘導心臟肥大模型大鼠，表現為β-MHC、α-actin、α平滑肌激動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)和B型利鈉肽(type B natriuretic peptide，BNP)的表達明顯升高，心臟/體質量比值升高，心室結構異常，心肌纖維化，血壓升高。使用Wnt信號抑制劑ICG-001治療后，明顯抑制了β-MHC、α-actin、α-SMA、ANP和BNP的表達，降低心臟/體質量比值，抑制心室重構及心肌纖維化，降低血壓，效果和氯沙坦相當。使用AngⅡ處理大鼠的原代心肌細胞，qRT-PCR檢測到Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt11、Wnt16 mRNA的表達升高，免疫熒光染色顯示，β-catenin表達升高并向核內轉移；蛋白免疫印跡法顯示，β-catenin表達升高，其下游Snail1、PAI-1和c-Myc靶基因表達增加。ICG-001能夠抑制β-catenin的激活及其下游靶基因的表達，抑制β-MHC、α-actin、ANP、BNP的表達，縮小肥大的心肌細胞。以上體內、體外實驗結果表明，RAS通過激活Wnt/β-catenin信號通路，誘導心肌細胞損傷并促進心臟纖維化，而使用ICG-001能阻斷該信號，對心臟起到保護作用。提示Wnt/β-catenin信號通路可能是RAS調控的下游系統，并且可以作為治療心臟病的新靶點[11-12]。

此外，在梗阻性腎病、阿霉素腎病、腎臟缺血/再灌注損傷以及5/6腎切除的殘余腎中，均可見到Wnt/β-catenin信號被激活，β-catenin在胞質中累積并轉移到核中，與TCF/LEF結合，促進靶基因的表達。通過生物信息學分析發現，TCF/LEF的結合位點位于AGT、腎素、ACE、AT1R和AT2R等所有RAS組分的基因啟動子區域，激活β-catenin能夠促進LEF-1和這些位點結合，過表達β-catenin能夠誘導多個RAS組分基因表達[13-14]。因此，Wnt/β-catenin信號也可能是RAS的上游調控系統。

2.2 Wnt/β-catenin信號通路和VDR在人源結腸癌細胞中，1,25(OH)2D3拮抗Wnt/β-catenin信號通路的機制主要有3種[15-16]：第一，誘導細胞內的VDR和β-catenin相互作用，減少β-catenin和TCF的結合，抑制下游基因的表達；第二，誘導E-cadherin的表達，促進β-catenin從細胞核中輸出并將其重新定位，黏附在細胞膜上；第三，1,25(OH)2D3誘導細胞分泌Wnt信號通路的抑制分子DKK1，從而抑制Wnt/β-catenin信號傳導。因此，從最終效應來看，1,25(OH)2D3明顯抑制結腸癌細胞β-catenin/TCF靶基因的表達，如c-MYC、TCF1、LEF1、AXIN2、PPAR、CD44、ENC1、EPHB2等。

進一步實驗發現，使用1,25(OH)2D3干預野生型小鼠后，VDR報告基因的活性上升，β-catenin的活性降低；而在VDR-/-的小鼠中呈現出相反的結果。在E-cadherin陽性和陰性的SKBR3的細胞中，1,25(OH)2D3對β-catenin信號的抑制作用相當。以上實驗表明，1,25(OH)2D3發揮抑制β-catenin信號的作用主要依賴于與VDR的結合，而不是E-cadherin。通過ChIP芯片篩選影響成骨細胞功能的基因研究中，Fretz等[17]發現，小鼠LRP5基因至少存在1個VDRE，與1,25(OH)2D3/VDR結合后，直接影響LRP5基因座內染色質結構的修飾，并在體內、外引起LRP5基因表達水平的增加，證實小鼠LRP5是1,25(OH)2D3的靶基因，并據此推測1,25(OH)2D3可能調控Wnt信號通路影響骨生成。

Guo等[18]發現，糖尿病小鼠腎組織VDR蛋白、mRNA水平降低，蛋白尿增加，GSK-3β、β-catenin的蛋白和mRNA水平升高。使用帕立骨化醇治療后，VDR表達上調，而GSK-3β和β-catenin表達下調。使用腎小球足細胞進行體外實驗，證實了上述結果。因此，提示激活VDR能夠調控Wnt/β-catenin信號通路的關鍵分子，減少糖尿病蛋白尿的產生，改善腎臟損傷癥狀。另外，部分受維生素D調節的靶基因的啟動子區中不含VDRE，維生素D/VDR是通過結合Wnt信號通路的β-catenin，直接發揮基因調節作用[19]。比如，He等[20]發現，帕立骨化醇不僅能抑制Wnt蛋白的表達，還能誘導VDR和β-catenin結合，抑制β-catenin下游基因的轉錄調控，從而起到防治慢性腎病的腎損傷、蛋白尿的產生及腎小球足細胞功能障礙的作用。結構分析發現，VDR通過AF-2區與β-catenin的C末端結合發揮作用，而β-catenin蛋白C末端乙?；潭鹊母叩?，影響其與VDR結合能力的強弱。

2.3 RAS和VDR糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的腎臟并發癥，是導致終末期腎病發病及死亡的主要原因之一。腎組織RAS活性的改變導致腎臟高濾過和高灌注是DN發病的關鍵因素之一。目前，臨床治療DN的一線用藥主要包括血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)。然而，由于此類藥物破壞了AngⅡ對腎素的反饋抑制環，引起腎素水平的升高，減弱RAS抑制劑的療效。那么，是否能夠通過抑制代償性腎素的升高，加強RAS抑制劑的療效。Zhang等[21]使用活性維生素D類似物度骨化醇(doxercalciferol)配合氯沙坦，治療鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病小鼠，結果顯示，聯合用藥組在預防蛋白尿、恢復腎小球濾過屏障結構和改善腎小球硬化方面的效果優于單一用藥組。表明維生素D在DN治療中有良好的應用前景，并證實了通過抑制代償性腎素的升高能夠加強RAS抑制劑療效的觀點[22]。

應用單側輸尿管結扎術構建梗阻性腎病模型，發現VDR-/-小鼠和野生小鼠均出現腎小管明顯萎縮、腎間質纖維化，VDR-/-小鼠腎臟損傷程度重于野生小鼠。已知VDR-/-小鼠激活RAS系統，引起AngⅡ在腎臟中的累積，并加重梗阻性腎病模型小鼠的腎臟損傷程度。通過使用ARB類藥物氯沙坦治療梗阻性腎病模型小鼠，明顯改善腎臟損傷程度。同樣，體外實驗發現，AngⅡ明顯促進VDR-/-小鼠的原代近曲腎小管細胞發生上皮細胞-間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)，誘導胞外基質的生成[23]。因此，VDR缺失，誘導RAS激活并引起腎損傷。

大量研究表明，血清中1,25(OH)2D3的水平與高血壓患者的血壓以及原發性高血壓患者的腎素活性之間呈負相關[24]。VDR-/-小鼠出現高血壓、心肌肥大、多飲等癥狀，使用ACE抑制劑卡托普利或AT1R拮抗劑氯沙坦治療，能夠糾正這些癥狀，說明這些異常癥狀出現與RAS活性升高相關。VDR-/-小鼠腎臟中腎素的表達上調；正常小鼠使用不同劑量的1,25(OH)2D3注射后，腎素的表達也受到抑制，說明1,25(OH)2D3能夠抑制腎素的生物合成。1,25(OH)2D3通過抑制腎素的合成、減少AngⅡ的表達，發揮降低血壓、抑制心肌肥厚的作用[25]。體外實驗證實，VDR-/-小鼠腎小球足細胞p53、AGT、腎素和AT1R的表達及AngⅡ含量升高，去乙酰化酶SIRT1的表達降低。VDR和過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)競爭性地與RXR結合發揮功能。當VDR缺乏時，PPARγ和RXR結合，而PPARγ會抑制SIRT1的表達。因此，VDR-/-小鼠表現出SIRT1的表達下調，進而促進了p53的乙?；饔?，p53能夠調控RAS的活化和心肌細胞的肥大[26-27]。因此，激活VDR可以通過直接抑制腎素或者間接抑制PPARγ/p53通路，調控RAS組分與RAS活性。

體外高糖培養狀態下，胰腺胰島β細胞RAS組分的表達上調，而骨化三醇可以通過抑制RAS組分高表達而刺激胰島素分泌[28]。VDR-/-小鼠β細胞RAS組分mRNA和蛋白的表達均較野生型小鼠升高，而且飲食誘導構建的維生素D缺少癥模型小鼠表現為葡萄糖耐量降低，胰島RAS組分基因表達升高，胰島功能障礙，表明維生素D/VDR通路能夠抑制胰島組織RAS組分表達。骨化三醇能夠促進胰島素的分泌，并改善高糖狀態下RAS組分的異常表達，提示活性維生素D對2型糖尿病具有潛在的保護作用，這可能是通過調控胰島細胞VDR信號通路，進而調節局部RAS的相關效應，以及調控胰島素分泌而發揮作用[29]。

3 展望

在冠心病、高血壓等心血管疾病中，RAS-Wnt/β-catenin信號級聯是主要分子通路，通過激活VDR，能夠抑制RAS-Wnt/β-catenin信號通路，起到抑制疾病進展，甚至逆轉疾病進程的作用。在慢性腎病中，活性維生素D通過VDR抑制Wnt/β-catenin-RAS信號通路，防治腎臟損傷。總之，VDR、Wnt/β-catenin、RAS 3個分子信號通路在心血管病、慢性腎病的病理生理過程中發揮著重要的生物調控作用。

ACEI、ARB等RAS抑制劑臨床主要治療高血壓、慢性腎病等。然而，由于此類藥物破壞了AngⅡ對腎素的反饋抑制環路，繼而引起腎素水平升高，減弱RAS抑制劑的療效?；钚跃S生素D類似物，如帕立骨化醇、度骨化醇、骨化三醇等通過激動VDR，抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活和腎素的表達，預防冠心病、高血壓、慢性腎病的發生和發展，但具體的臨床療效還有待進行多中心、大樣本的臨床驗證。今后，研發靶向作用于Wnt/β-catenin/RAS的維生素D類似物，尤其從中藥與天然產物中研發維生素D樣作用的活性成分，同時有效治療心血管疾病、慢性腎病等多種慢性疾病，不僅能夠減輕醫療經濟負擔，還能減少患者的服藥量，提高患者生活質量。