抗結核藥物誘導結核分支桿菌形成L型及其特性的觀察分析

宛 洋

（沈陽市第十人民醫院，遼寧 沈陽 110044）

結核病是世界性難治疾病之一，雖然通過預防接種的方式一定程度上能夠對該疾病起到一定的預防作用，但仍然會出現許多成年人再發性結核感染病例結核分支桿菌。人群對于結核分支桿菌免疫力降低、結核分支桿菌出現抗原性變異以及耐藥性等因素是無法有效控制結核病的主要原因之一。經調查研究發現，結核分支桿菌在出現細菌L型或細胞壁缺陷后，很有可能會造成結核病再發性感染。為了對抗菌藥物與抗結核藥物之間的作用關系以及結核分支桿菌L型有更加良好的了解，可以通過非高滲透壓培養基體外最低抑菌濃度試驗，對抗結核藥物作用下結核分支桿菌的L型形成情況以及部分特殊性情況進行觀察與研究，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 材料：本次實驗研究所選用的材料主要包含結核分支桿菌菌種、培養基、抗結核藥物、抗菌藥物以及基因檢測試劑。結核分支桿菌菌種經過20 d的培養基接種后，采取比濁法對蘇通培養基內的培養物進行稀釋，經過稀釋后的結核分支桿菌深度為每毫升1億個菌細胞。

1.1.2 培養基：本次實驗研究所選用的功能培養基成分包含蒸餾水100 mL，甘油6 mL、枸櫞酸鐵銨0.005 g、MgSO4·7 H2O 0.05 g、K2HOP 40.05 g、枸櫞酸鹽0.2 g以及天門冬素0.4 g。

1.1.3 抗結構藥物：本次實驗研究所選取的抗結核藥物為乙胺丁醇、異煙肼以及利福平口服劑。利用蒸餾水分別對各種藥物進行稀釋并將其加入培養基，培養基內每毫升藥物的濃度為乙胺丁醇1、2.5、5 μg，異煙肼0.01、0.04、0.08 μg，利福平0.05、0.1、0.2 μg。

1.1.4 抗菌藥物：臨床治療用鏈霉素、林可霉素、氧氟沙星、慶大霉素、紅霉素和氯霉素注射劑以及諾氟沙星口服劑。將各種抗菌藥物利用蒸餾水分別對其進行稀釋處理后將其加入培養基，培養基內每毫升藥物的濃度為鏈霉素6 μg，諾氟沙星8 μg，林可霉素2 μg，氯霉素12.5 μg，慶大霉素4 μg，紅霉素2 μg，氧氟沙星2 μg。

1.1.5 基因檢測試劑：本次實驗研究所取勝的基因檢測試劑為由華美生物工程公司所造成的PCR檢測試劑盒。

1.2 方 法

1.2.1 誘導與分離：于乙胺丁醇、異煙肼、利福平培養基中加各種結核分支桿菌，將其置于37 ℃的溫箱中，通過顯微鏡對L型的形成情況進行觀察。待L型形成完畢后對其進行過濾處理，于蘇通培養基中放置過濾物，將其置于37 ℃的溫箱中，對L型的生長情況進行觀察。經過密集生長階段后作磷鎢酸負染色、抗酸染色后鏡檢、革蘭染色后通過透射電鏡對其進行觀察。同時也含有其他藥物、不含抗結核藥物的蘇通培養基內接種結核分支桿菌，將其置于37 ℃的溫箱中，通過顯微鏡對L型生長情況和細菌進行觀察。

1.2.2 敏感性實驗：將L型非高滲透壓培養基傳代純培養物及結核分支桿菌細菌型菌液分別接種于抗結核藥物和不同抗菌藥物的蘇通培養基內，通過顯微鏡對L型或結核分支桿菌的生長情況進行觀察，對比不含藥物培養基中的生長情況。通過肉眼對培養基混濁情況進行觀察，對藥物敏感性進行判斷，通過顯微鏡對L型生長情況進行判斷，并根據判斷結果對藥物敏感性進行觀察。

1.2.3 對非高滲透壓培養基中的結核分支桿菌L型進行分離提取，對L型進行照像、瓊脂糖凝膠電泳以及DAN擴增處理。

2 結 果

于培養基內對抗結構藥物進行培養，結構分支桿菌L型清晰可見。其中乙胺丁醇2.5 μg/mL和5 μg/ mL、異煙肼0.04 μg/ mL、利福平0.1 μg/mL下所生成的L型數量最多。再經過一段時間的培養后，雖未見細菌型生長，但發現L型數量明顯增加。

2.1 藥物敏感性分析：經過為期15日的培養，鏈霉素6 μg/mL、氯霉素12.5 μg/mL、乙胺丁醇1 μg/ mL、異煙肼0.01 μg/ mL、利福平0.1 μg/mL培養基中的結核分支桿菌細菌型均未見生長，但可見L型。在林可霉素2 μg/ mL、諾氟沙星8 μg/mL、氧氟沙星2 μg/mL、慶大霉素4 μg/mL、紅霉素2 μg/mL培養基中均發現混濁情況，其中慶大霉素、氯霉素未見L型

2.2 L型的結核分支桿菌特異性基因：對L型的染色體DNA進行電泳以及PCR擴增處理后，可見與親代細菌型和陽性對照一致的帶型。

3 討 論

經實驗研究發現，結核分支桿菌一方面具有肽聚糖，同時其細胞壁結構十分復雜，也含有一定量的蛋白質與脂類物質。鏈霉素、乙胺丁醇、異煙肼、利福平是最為主要的抗結構藥物，對于結核分支桿菌的蛋白質、脂肪以及核酸代謝產生一定的抑制作用。通過本次實驗研究可以發現，結核分支桿菌對于鏈霉素、乙胺丁醇、異煙肼以及利福等藥物均具有殺菌以及抑制作用，對于L型無抑制作用。也就是在L型的狀態下，其細胞壁的蛋白質、脂質以及糖類物質出現敏感性降低的現象。既在抗結核藥物的作用下，結核分支桿菌形成L型，一定程度上源自于抗結核藥物的無效與治療不徹底。因此，在臨床治療過程中，需要采取抗菌藥物與抗結核藥物聯合使用的方法，能夠提高患者的治療有效性。