河西走廊玉米種子攜帶病原菌真菌的研究

鄭天翔曹 禮

(1.河西學院農業與生物技術學院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000)

河西走廊作為全國最大的雜交玉米種子生產基地，主要集中于武威、張掖、酒泉三大農業灌溉區，2013年以來，制種面積每年穩定在10萬hm2左右，占全國制種面積的39.3%，制種產量5.8億kg，占全國制種量的42.6%[1]，河西走廊玉米種子質量對全國玉米產業的發展起到至關重要的作用。然而，隨雜交玉米種子生產基地土地連作突出、抗病性差的親本組合大面積單一種植、追求高密度與高水肥的耕作制度改革、氣候變暖而生育期提前和病原越冬基數增多[2]等因素為玉米苗期、穗部病害、葉部病害等的發生創造了條件。據調查，河西走廊玉米苗枯病在一般地塊發病率在10%左右，發病重的地塊40%～60%[3]，穗腐病病株率62.5%～82.2%[4]，葉部病害大斑病病株率39.3%～97.06%、小斑病病株率26.12%～96.57%、彎孢菌葉斑病病株率12.9%～93.22%[5]。致使種子帶菌率上升，種子病原菌結構發生變化，引起種子變色腐爛，種子的發芽率低、發芽勢弱，種子帶菌成為影響河西走廊玉米種子質量的制約因素。

各國對種子帶菌檢驗采用方法不同，國外早期針對真菌采用“孵化檢驗”或田間種植檢驗的方法[6]，后逐漸采用抗生素或其它選擇性媒介、LIST、PCR 等技術，極大地提高了檢驗靈敏度和效率[7]；國內多地對玉米種子帶菌檢驗，認為玉米種子帶菌是導致種子活力下降的重要因素[8]，高曉梅等[9-10]報道遼寧省玉米種子真菌達16個屬26個種，龍書生等[11]鑒定出陜西關中西部玉米穗粒腐病病穗籽粒表面和內部寄藏的真菌有11個屬14個種。但作為全國最大玉米制種基地，河西走廊的種子帶菌情況還未見系統性研究報道。為此，以河西走廊玉米制種基地生產的種子為研究對象，檢測種子帶菌種類、優勢種群，旨在為預防控制玉米種傳病害、檢驗檢疫、藥劑包衣和生物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

分別在張掖市12個制種企業、武威市4個制種企業、酒泉市4個制種企業采集新收獲的50個玉米品種(組合)種子。

1.2 種子帶菌檢測方法

1.2.1種子外部帶菌檢測

每個品種隨機選取100粒種子，放入滅菌的250 mL三角瓶中，加50 mL無菌水后充分振蕩，吸取10 mL懸浮液，2 000 r/min離心10 min，倒去上清液，加5 mL無菌水均勻懸浮后取出適當體積用無菌水進行系列梯度稀釋，每個稀釋梯度菌懸液吸取100 mL涂抹到直徑90 mm的PDA平板上(PDA中加適量乳酸抑制細菌)，每個濃度3皿，置20 ℃恒溫箱中黑暗條件下培養觀察，5 d后觀察平板上的菌落，根據稀釋倍數和檢測種子數計算種子外部攜帶真菌的孢子負荷量和檢出真菌的分離比例。每個供試品種重復4次[8]。

孢子負荷量(個/粒)=(3皿菌落總數/0.3 mL)×稀釋倍數×50 mL/100粒；

分離比例(%)=(某類真菌菌落個數/菌落總數)×100%。

1.2.2種子內部帶菌檢測

每個供試品種隨機選100粒，先將玉米種子在70%酒精中浸15～20 s，然后移入0.1%升汞液中殺菌0.5～1 min，再用無菌水沖洗3次。將經表面殺菌的玉米籽粒置于盛有PDA平板上，每皿擺放10粒，每品種重復3次。于25℃溫箱中培養4～5 d，當種子周圍長出菌絲體或種子表面有霉層時，將菌絲或霉層移入PDA培養基上進行純化培養，待長出籽實體后進行真菌鑒定[8]。

種子帶菌率(%)=(帶菌種子數/檢測種子總數)×100%；

某菌分離率(%)=(帶某菌種子數/檢測種子總數)×100%。

1.2.3病原真菌的鑒定

根據分離到的真菌在PDA培養基上培養特性，鏡檢病菌形態特征，并參照相關真菌鑒定的工具書[12-14]。

2 結果與分析

2.1 玉米種子外部帶菌情況

從培養平板菌落特征及顯微鏡檢驗看，共檢出鐮刀菌屬(Fusariumspp.)、根霉屬(Rhizopusspp.)、青霉屬(Penicilliumspp.)、鏈格孢屬(Alternariaspp.)、凸臍蠕孢屬(Exserohilumspp.)、平臍蠕孢屬(Bipolarisspp.)、黃曲霉(Aspergillusspp.)、枝孢屬(Cladosporiumspp.)、黑孢霉屬(Nigrosporaspp.)、木霉菌屬(Trichodermaspp.)等真菌10個屬。其中，鐮刀菌主要檢出串珠鐮刀菌(F.moniliforme)和禾谷鐮刀菌(F.graminearum)2個種；顯微鏡檢驗洗滌液時，除檢測到上述幾種真菌外，還可檢測到黑粉菌屬(Ustilagospp.)、腐霉菌屬(Pythiumspp.)2個屬。

從分離比例和孢子負荷分析看，各種品種所攜帶的病原真菌種類及數量、孢子負荷量均有所差異。其中檢出率最高的是鐮刀菌(Fusariumspp.)，豫玉22分離率最高(達67.74%)，良玉188分離率最低(為0)，平均分離率41.52%。有27個品種分離率在43.75%～67.74%之間，高出平均值達2.23%～26.22%，占分離品種54%；根據分離率的高低，檢出依次為根霉屬>青霉屬>鏈格孢屬>凸臍蠕孢屬>黃曲霉>平臍蠕孢屬>枝孢屬>木霉菌屬>黑孢霉屬；從每粒種子表面孢子負荷量分析，品種浚單29、鄭單958孢子負荷量最高(600個/粒)，品種良玉188負荷量最低(116.67個/粒)，平均負荷量322.67個/粒。有21個品種孢子負荷量超過平均值，為333.33～600個/粒，高出平均負荷量在10.66～277.33個/粒，占分離品種42%。品種的孢子負荷量Log值高于平均值2.48的占分離50%。

2.2 玉米種子內部帶菌情況

經分離培養法檢驗，檢出的真菌種類與洗滌培養法檢出的真菌相同，但分離率與帶菌率與洗滌培養法不同。分離結果顯示，檢出的內部帶菌種類間差異比較明顯，鐮刀菌(Fusariumspp.)分離率最高為豫玉22，達61.11%，玉油1號、士海718、土海916、海單9號、登海3737、良玉9、良玉188、華農138、華農866、中科16等10個品種上分離最低，為0，平均分離率29.20%，有28個品種分離率超過平均值，為30.00%～61.11%，高出平均值0.8%～31.91%，占分離品種的56%。根據分離率的高低，病原菌依次檢出鏈格孢屬>凸臍蠕孢屬>青霉屬>黃曲霉>黑孢霉屬>枝孢屬>木霉菌屬>根霉屬。

試驗結果表明，種子帶鐮刀菌率在品種間也存在不同差異。帶鐮刀菌率最高的是豫玉22、浚單29，為36.67%。除不帶鐮刀菌的10個品種外，最低的是鄂玉16、濟玉1號、大豐30等3個品種，為3.33%。平均帶鐮刀菌率為12.87%，27個品種超過平均值，占供試品種的54%；

種子帶菌在品種間也具有一定差別。種子帶菌的主要菌群有鐮刀菌屬、鏈格孢屬、凸臍蠕孢屬、青霉屬、黃曲霉、黑孢霉屬、枝孢屬、木霉菌屬、根霉屬等，還有一些未鑒定的菌群；帶菌率最高是浚單29，為63.33%。最低是華農138、華農866，為10%。平均種子帶菌率37.60%，帶菌率高于平均值的品種占48%。

2.3 2種方法的比較

從2種方法分離結果看，一個共同特點是鐮刀菌(Fusariumspp.)分離頻率最高，且以串珠鐮刀菌(F.moniliforme)和禾谷鐮刀菌(F.graminearum) 2個種為主，僅鐮刀菌分離率有所差別，洗滌檢驗法平均分離率最高達41.5%，PDA平板法平均分離率最高達29.20%，二者平均分離率相差12.3%，說明鐮刀菌既可在種子表面腐生，又可內藏寄生種子內；其次是鏈格孢屬(Alternariaspp.)、凸臍蠕孢屬(Exserohilumspp.)通過PDA平板法分離率較洗滌法高，分別達15.95%、10.17%，高出6.85%、5.48%。說明鏈格孢屬、凸臍蠕孢屬是玉米種子內藏寄生菌；三是黑孢霉屬(Nigrosporaspp.)、黃曲霉(Aspergillusspp.)、木霉菌屬(Trichodermaspp.)在PDA平板法中分離率有所上升，分別為5.91%、8.34%、4.40%，較洗滌法分離率高出4.87%、3.05%、1.02%，這3種菌一直被認為是種子的腐生菌，說明玉米種子的寄生性在上升；其他菌在PDA平板法中的分離率低于洗滌法，說明經洗滌消毒后外部腐生的數量在減少。

3 結論與討論

1) 試驗結果表明，從玉米種子外部和內部檢出情況看，攜帶的真菌類群主要有10個屬，與高曉梅等[9-10]報道玉米種子攜帶真菌有16個屬有差異，尚未檢測到枝頂孢屬(Acremonium)、刺毛霉屬(Actinomucor)、毛殼屬(Chaetomium)、附球菌屬(Epicoccum)、串棒霉屬(Gonatobotrys)、糞殼菌屬(Sordaria)等6個屬；從分離率的高低分析，表面攜帶優勢種群為鐮刀菌(Fusarium)、根霉菌(Rhizopus)、青霉菌(Penicillium)、鏈格孢菌(Alternaria)，種子內部寄藏的真菌主要有鐮刀菌(Fusarium)、鏈格孢菌(Alternaria)、凸臍蠕孢菌(Exserohilum)，這與李健強等[15]、徐秀蘭等[8]報道相一致；因此，需要密切檢驗種子帶菌和監測種子病害的發生情況。

2) 試驗結果顯示，河西走廊部分玉米種子帶菌率高，帶菌量大，50個檢測品種中，56%的品種帶菌率比平均值高(36.70%)，54%的品種帶菌量比平均值大(332.67個/粒)；玉米品種間帶菌率及帶菌量存在一定差異，如豫玉22、浚單29、鄭單958等無論外部、內部帶菌率和帶菌量均比較高，如鐮刀菌、鏈格孢菌等的帶菌率較高，這與田間苗枯病、頂腐病等苗期病害發病率在15%～25%之間是相互吻合。玉油1號、士海718、土海916、海單9號、登海3737、良玉9、良玉188、華農138、華農866、中科16等外部帶菌量均比平均值低，內部帶菌率為0，田間苗枯病及頂腐病的發病率均低于5%；分析認為，帶菌率和帶菌量高低與品種繁種年份長短、連作現象、親本組合的抗病性關系密切。帶菌低的繁種年份較短，一般3～5年。有些親本材料對優勢種群的抗病性較弱，而親本材料既在河西走廊繁殖，又在河西走廊制種，侵染循環的周期縮短，造成苗期病害嚴重發生。一般帶菌率和帶菌量高的品種在河西走廊繁種年份均在10年以上，土壤連作現象突出，影響土壤中有益微生物數量和土壤活性[16]，種子帶菌導致土傳病害的加重。

3) 玉米種子分離病菌與玉米果穗腐病具有一定的相關性。如鐮刀菌、平臍蠕孢、鏈格孢菌、青霉、木霉、曲霉等分別引起穗腐病，黑孢菌引起裂軸病，根霉引起果穗煤污病，枝孢霉引起黑霉病[17]。其中一些病菌是先寄生于葉、莖引起葉部和莖部病害，從苞葉侵染果穗而附著于種子表面，之后逐漸寄藏于種子內。如鐮刀菌、平臍蠕孢引起莖基腐病，鐮刀菌、鏈格孢菌引起鞘腐病，鏈格孢菌、平臍蠕孢、枝孢霉引起葉斑病[17]，這些病菌由莖、葉、葉鞘等部位向果穗擴展，造成種子帶菌；一些是腐生菌青霉、木霉、曲霉、根霉、黑孢霉等在果穗收獲時，因受田間鉆蛀性害蟲危害、鮮穗堆集而通風不良、涼曬時遇多雨或潮濕環境條件等因素影響，腐生菌迅速繁殖附著或侵染種子內部，形成致病菌，造成種子帶菌而成為下一季玉米苗期病害主要侵染源；有關攜帶真菌的寄生部位的研究，馬奇祥等[18]報道玉米種子外部主要腐生于果皮與種皮(籽實皮)表面，內藏真菌主要寄生于胚乳內。這方面報道還不多，有待進一步研究。