食源性微生物的分子檢測方法

張雪穎

（1.蘇州大學 江蘇蘇州 215123；2.劍橋-蘇大基因組資源中心）

1 前言

食源性病原微生物和腐敗有機體的生長對公共衛生和食品工業都構成了巨大的威脅。為了確保食品微生物的安全性和質量，需要有效的檢測方法監測原材料、食品加工環境和最終產品中的污染物。食品工業采用傳統的微生物檢測方法觀察人工培養基中細菌細胞的物理生長。但傳統方法費時費力，通常情況下最初的結果交付需要2～3 d，最終確認需要10 d，這顯然給許多工業應用帶來了不便，特別是在當今的全球分銷市場上。分子技術的最新進展使檢測和鑒別比傳統的方法更快、更方便、更靈敏、更特異。

分子檢測技術是基于對核酸的識別和擴增。在過去的十幾年中，許多生物在公共領域獲得了大量的遺傳信息，為基于DNA/RNA的測試提供了有力地支持[1]。這些檢測方法很好地替代了傳統的培養方法。聚合酶鏈式反應 （PCR）和核酸序列擴增(NASBA)等方法為快速、特異、敏感地檢測食品中的微生物污染提供了很大的優勢。此外，使用微陣列可以在一次檢測中同時檢測和鑒定多種病原體和基因。

2 熒光原位雜交

熒光原位雜交技術是利用特異性寡核苷酸探針直接從臨床、食品和環境樣品中檢測和鑒定特定微生物的方法。檢測時，用適當的化學固定劑處理微生物細胞，并用寡核苷酸探針固定在載玻片上或溶液中。在嚴格洗滌以除去未結合的探針后，染色的細胞通過熒光顯微鏡被檢測到。熒光原位雜交技術特異性的關鍵是從靶細菌中選擇一種獨特的寡核苷酸片段作為探針。毒力基因經常被用作探測目標來檢測食源性病原體，因為它們通常在特定組中是保守的。通過使用核糖體RNA作為靶標，大大提高了熒光原位雜交檢測的靈敏度[2]。

3 常規PCR

PCR是由Kary Mullis于1983發明的一種DNA片段擴增技術,可以將一些拷貝的靶DNA擴增至數千到數百萬拷貝的特定DNA序列。在微生物診斷PCR中，使用特異性引物擴增目標DNA片段。擴增產物的存在表明測試樣本中存在微生物。常規PCR方法在瓊脂糖凝膠上用電泳和溴化乙錠染色法顯示擴增產物。有時為了進一步確認，需要進行Southern印跡等分析，用來區分真正的放大分子和非特定的最終產品。自出現以來，PCR被認為是分子生物學領域最重要的研究成果。PCR具有特異性、敏感性、快速性和準確性等優點。然而，常規PCR進行食品微生物檢測時存在若干缺陷：首先，由于低水平的污染病原體或抑制酶反應的殘留食物成分可能獲得假陰性結果；其次，僅存在于實驗室中的偶然DNA的非特異性擴增或來自于死亡細胞的DNA碎片可導致假陽性檢測[3]；最后，傳統的PCR不能充分量化，食品行業對PCR的需求也在不斷增長。

4 實時PCR

實時PCR技術的發展是PCR檢測技術的重大進步。實時PCR在每個復制周期中都包含熒光探針，從而使用光學模塊進行監測。它可以快速、動態地評估PCR擴增產物，減少外來核酸的污染。SYBR Green、分子信標和Taqman探針是3種主要的實時PCR形式。

SYBR Green是一種高度特異性的雙鏈DNA結合染料，當它被添加到PCR產物中時，會嵌入雙鏈擴增產物中。SYBR Green實時PCR是所有實時PCR檢測中最經濟、最簡單的選擇。然而，所有雙鏈核酸片段，包括引物二聚體，都能與SYBR Green結合并產生熒光信號[4]。

分子信標實時檢測采用單鏈寡核苷酸探針檢測擴增產物。該探針形成莖-環發夾結構，并用熒光團和猝滅劑標記。環路序列與擴增產物互補，通過退火位于探針序列任一側的互補臂序列形成莖。分子信標的發夾結構是封閉的。將信標環與擴增產物雜交迫使莖區開放，誘導檢測到的熒光信號。如果沒有擴增產物，則莖保持閉合且猝滅劑組分吸收熒光信號[5]。

在Taqman實時PCR中，用5’熒光報告染料和3’猝滅染料標記探針進行信號檢測。最初，探針與模板退火，由報告染料發射的熒光信號被附近的猝滅染料吸收。隨著擴增過程的進行，寡聚探針的互補序列被聚合酶的5’外切酶活性酶解，而游離的報告染料發出信號。猝滅染料距離太遠，無法吸收熒光信號，使來自報告染料的信號被光學模塊捕獲。

實時PCR系統，特別是Taqman實時PCR是檢測食品樣品中細菌、真菌和病毒污染的領先技術。通過將PCR最終產物與寡核苷酸探針雜交，實時PCR提供了較高的速度和特異性。實時PCR還可以獲得具有有限操作和擴增產物污染的結果。利用不同的引物和探針組合，實時PCR能夠同時識別同一反應中的多種生物或多種基因。此外，實時PCR結果是定量的。模板DNA拷貝數可以確定，因為相對熒光單位(CT值)記錄在每個放大周期。然而，如上所述，實時PCR的主要限制之一是無法區分活細胞和非活細胞。

5 DNA微陣列

DNA微陣列是排列有數千個寡核苷酸點或cDNA探針的玻璃或硅芯片。待分析的靶DNA分子與陣列上的識別探針雜交。由陣列上的綁定目標生成的信號允許基于探針的已知信息進行識別。該技術可以允許單個小陣列測定中平行鑒定和表征以千計的寡核苷酸。一般而言，DNA微陣列實驗設計和典型的步驟包括：（1）寡核苷酸探針合成；（2）陣列制備；（3）樣品制備；（4）檢測雜交；（5）掃描和檢測；（6）數據分析[6]。

對于食品微生物分析，寡核苷酸芯片為多種毒力基因提供了高通量分析，同時檢測多種食源性致病菌。用于食品微生物分析的芯片初始應用由食品藥品監督局（FDA）完成，在各種毒力因子的基礎上鑒定腸道食品病原體。近年來，DNA微陣列技術已被用于檢測單個或多種病原體，如李斯特菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌、志賀菌、大腸桿菌和沙門菌。一般來說，核糖體RNA編碼基因和各種毒力基因用于細菌鑒定。通常，擴增靶生物體的特定片段，然后通過雜交微陣列進行鑒定。PCR擴增最初用于提高檢測靈敏度和降低非特異性背景DNA的噪聲，從而使復雜樣品中的低計數病原體細胞得以檢測[7]。

微陣列需要昂貴的設備，且對病原體的計數也很有限。然而，微陣列是快速的、特異性的，具有高樣品體積，并能同時檢測多種病原體。基于微陣列的檢測方法的優勢使其優于許多技術，成為食品微生物檢測的潛力股。

6 食源性微生物的分子檢測方法的局限性

與常規培養和免疫技術相比，分子檢測方法具有明顯縮短檢測時間的優勢。它們還提供半定量信息，并確保敏感檢測復雜食品基質中的特定目標。盡管有這些優點，分子方法在食品分析中的應用是有限的。一個原因是殘留食物成分的干擾和食品樣品中常見的低水平污染物產生的假陰性[8]。例如，之前在牛奶中的研究已經證明了分子檢測方法的局限性：牛奶中存在的蛋白酶抑制了降解Taq聚合酶的PCR；鈣離子通過改變反應的緩沖能力阻礙了擴增。通過使用內部陽性對（IPC）可以發現擴增抑制劑的存在。IPC是精確已知量的核酸片段，其被添加到反應中并與靶序列共同擴增。如果沒有信號或微弱的放大信號由IPC產生，則可以抑制和檢測效率。

如上所述，分子檢測方法的缺點是靶向DNA分子不能區分活細胞和非活細胞。這在食品安全和質量控制中尤為重要，因為只有活細胞才有可能構成潛在風險。當前亟需適當的新方法或對已知分子方法的改進對食品中的活細胞進行快速檢測。