腹瀉型腸易激綜合征肝郁脾虛型病證結合大鼠模型的研究方法*

任培培，汪龍德，劉俊宏，趙 麗，吳亞娜，吳紅莉，楊 博

(1.甘肅中醫藥大學,甘肅 蘭州730030; 2. 甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州730030； 3.蘭州大學，甘肅 蘭州 730030)

腸易激綜合征 (irritable bowel syndrome，IBS)是一種功能性腸病,表現為反復發作的腹痛、排便異常或排便習慣改變。該病缺乏可解釋癥狀和生化異常的形態學改變[1]，可不同程度地降低生活質量，臨床上較難徹底治愈。根據患者的主要異常排便習慣,將IBS 分為4個主要的亞型[1],其中腹瀉型腸易激綜合征(IBS-D)最為常見，約占全部IBS患病人群的2/3[2]。中醫藥治療此病有一定的優勢，但缺乏明確的療效機制，需要開展大量的動物實驗。近年來,為了探索病證結合動物模型的研制, 許多醫家進行了廣泛的研究, 取得了較理想的成果, 然而仍存在諸多問題有待進一步解決。在此，筆者嘗試總結建立IBS-D肝郁脾虛型動物模型的一般方法和評價體系。

1 疾病模型的建立方法

張北華[3]認為，目前IBS-D動物模型多在內臟高敏感動物模型的基礎上疊加致瀉因素來造模。常用的造模方法包括：①精神心理應激法。包括束縛應激、新生期母子分離應激、慢性不可預知應激、避水應激、游泳致疲勞應激、慢性激怒應激等。②病原體感染法。常用的病原體有旋毛蟲、彎曲桿菌、志賀痢疾桿菌。③結腸化學刺激法。常用的化學物質有醋酸、芥子油、脫氧膽酸、丁酸鹽、酵母聚糖。④結直腸擴張法。結直腸擴張是一種局部機械性刺激，此法是實驗室和臨床評估腸道感覺時使用最廣泛的刺激方法[4]。⑤過敏刺激法。⑥除了以上模擬發病危險因素所用的造模方法以外，還有腦室內注射神經遞質致敏、腦腸相互作用定向應激、腹腔注射前體致敏、腹腔注射抗生素導致細菌潛生體定植、基因敲除等，但這些方法并沒有被廣泛應用。

2 “證”模型的建立方法

中國古代醫學中無“腸易激綜合征”這一病名。根據IBS-D的主要臨床癥狀可將其歸屬于“泄瀉”“腹痛”等范疇。近年亦有學者將其歸為“郁證”范疇[5]。劉康毅[6]從知網、維普、萬方等數據庫收集了近十五年與IBS-D相關的文獻(1 189篇)，通過嚴格篩選從中提取IBS-D中醫相關證候要素、證型等，發現肝郁脾虛是出現頻次最高的證型。 肝郁脾虛證屬于中醫傳統證候，造模方法也需以傳統中醫的病因病機理論為依據。肝郁脾虛多因情志失調、憂思惱怒而橫逆乘脾,脾失健運,脾氣漸虛。一般認為，肝郁脾虛時，機體存在神經-內分泌-免疫系統失調、腦腸軸異常、腦電生理功能紊亂[7]。這與IBS-D的西醫學發病機制中腦-腸軸調節異常相吻合。

石亮[8]發現目前肝郁脾虛證的動物模型主要有3類：①藥物造模法。通過大量藥物如艾葉煎液、腎上腺素、CCl4等皮下大量注射造成急、慢性中毒性肝損傷。②情志刺激法。通過頸部帶枷喂養法、捆綁法或夾尾激怒打斗法等改變動物的生理狀態。③藥物合情志刺激法結合。通過翻閱文獻，筆者發現學者普遍認為藥物造模法會一定程度上造成肝臟急、慢性的實質性損傷，但肝郁不能等同于肝損傷。綜上可以認為，情志刺激造模法更加符合中醫傳統理論。

3 疾病模型特征與“證”模型特征的評價

3.1 IBS-D疾病模型特征的評價

從目前的動物模型來看，主要圍繞病理生理特征進行研究。目前大多數學者認為IBS-D并非單因素導致,是多種因素共同作用的結果。內臟敏感性增高、胃腸動力學異常、腦-腸軸調節異常、精神心理障礙、腸道感染及免疫功能紊亂、腸道微生態失衡、飲食及遺傳因素等與該病的發生過程密切相關[9]。已知其病理生理學基礎主要是胃腸動力、內臟感知異常[1],那么IBS-D大鼠模型的建立可以以此作為評價標準并結合腸神經系統的神經遞質觀察。

3.1.1 內臟敏感性評價

張北華[3]總結出近年來國內內臟敏感性評價中最為常用的主要有以下幾項：①腹部回縮反射。通過肉眼觀察腹部的反應，可間接反應內臟運動的反射。②腹壁肌電活動。此是動物實驗中衡量內臟敏感性最常應用的方法，指標客觀，且操作相對簡單。③神經元細胞的電生理。此是將微電級插入分離出的相應脊髓節段的單個神經元細胞，具有創傷性，對操作技術和設備的要求較高，因此一定程度上限制了該法的廣泛運用。④離體腸管神經肌肉的收縮反應。

3.1.2 胃腸動力評價

采用胃排空小腸推進率測定法、胃腸道腔外電橋式應力傳感器記錄法、胃腸激素(胃泌素、胃動素、生長抑素等)測定、免疫組織化學方法、離體體胃腸平滑肌肌條動力測定、胃腸內壓描記法[9]。

3.1.3 神經遞質指標評價

黃辰等[10]從文獻檢索中得出用于評價IBS-D動物造模的常用指標有胃泌素、胃動素；趙梁等[11]通過觀察發現生長抑素 和血管活性腸肽、 5-羥色胺等腦腸肽含量有明顯變化。查閱文獻發現,5-羥色胺、P物質、血管活性腸肽、生長抑素、一氧化氮等在腸易激綜合征發病機制中的作用研究最多。由于目前還沒有統一的組織學評價指標，尚將此作為IBS-D動物造模的評價指標。

3.1.4 腹瀉的評價

國內外研究評價腹瀉主要從大便的含水量、評分，腹瀉的潛伏期，腹瀉率，稀便率，稀便級，腹瀉指數和體質量增長率幾個方面進行[12]。

3.2 肝郁脾虛型特征的評價

3.2.1 肝郁評價方法

肝郁脾虛證患者除了腹痛、腹瀉的癥狀外，還有急躁易怒或情志抑郁、善太息癥狀，多因情志因素誘發或加重。中醫學認為肝郁多由情志不暢所致，日久犯脾而致脾虛。因此對中醫肝郁證動物模型的評價多借鑒抑郁癥的評價方法，常用的評價方法[3]有以下幾個方面：①一般狀態觀察。通過大鼠皮毛變化、對外界刺激的反應、精神狀態情況等來評價。②糖水偏好[10]。依據嚙齒類動物喜嗜甜味溶液這一特點，用糖水作為獎賞，應激前后糖水偏好系數可作為評價大鼠快感缺失的重要方法，糖水偏好降低是抑郁大鼠的核心癥狀。③高架十字迷宮[10]。此是國際上公認評估焦慮行為的方法，利用大鼠對于新事物的好奇、高懸開放環境的恐懼和天生對黑暗環境的傾向。④曠場實驗[10]。常以此用來評價肝郁脾虛動物造模期間的精神狀態。⑤強迫游泳[10]。此是將大鼠被迫放在一個無法逃脫的游泳環境中，先出現游泳掙扎試圖逃脫，后絕望轉而放棄游泳。⑥懸尾實驗[10]。將大鼠尾尖向上懸掛于固定裝置上，大鼠為了擺脫這種不舒服體位出現掙扎，一段時間后主動放棄掙扎。

3.2.2 脾虛評價方法

脾虛證患者多表現為納差食少，大便溏，體質量下降。通過觀察各組大鼠體質量、大便和造模后進食量來評價其脾虛情況。

4 IBS-D大鼠模型肝郁脾虛的造模方法

4.1 乙酸灌腸刺激

李燕舞等[13]以乙酸每天1次、連續2周灌腸來建立 IBS-D 內臟高敏大鼠模型，并與母子分離(從出生后第2天開始母子分離，每天3 h)2周建立的模型做對照。以大鼠腹部回縮反射( AWR) 評估腸道敏感性來評價疾病；避水應激實驗觀察其排便數量對腸道運動進行評估腹瀉癥狀的建立。結果：兩種方法均可造成大鼠內臟高敏模型，但母子分離模型能更好地模擬IBS 腹痛及排便異常癥狀。遺憾的是該實驗未對肝郁脾虛證型的建立進行評估。

4.2 母嬰分離+乙酸刺激+束縛應激

柴玉娜等[14]按照文獻方法采用母嬰分離+乙酸刺激+束縛應激制備肝郁脾虛模型大鼠。造模結束后,用腹部回縮反射方法評估腸道敏感性;從進食量、糖水偏好率、自主活動情況進行行為學評分，以對肝郁脾虛證型的建立進行評估。該實驗未對腸道動力及腹瀉情況進行評估，此法能否建立穩定的IBS 療效機制的動物模型，但仍需要進一步的研究。

4.3 醋酸灌腸+夾尾刺激法

劉啟泉等[15]采用 1 mL 1%醋酸灌腸結合改良夾尾刺激 3周綜合造模。每周 3 次，每次 30 min，期間同時對大鼠施行強光刺激、敲打鼠籠等以減少大鼠休息時間。造模過程中觀察大鼠糞便情況，超過 25%的稀便、少于 25%質地堅硬糞便即為造模成功。通過觀察大鼠皮毛變化、精神狀態、稀便程度確立證型，觀察大鼠糞便情況評價腹瀉情況和肝郁脾虛的確立。鏡下觀察結腸組織，檢驗腸道變化建立疾病，通過造模前后IL-1β、P物質、5-羥色胺含量的變化評價疾病的建立。此法的評價指標簡單，但能否再次復制仍需要進一步的研究。

4.4 饑飽失常+番瀉葉灌胃+強迫游泳

郭紅[16]在使用腸激寧方治療肝郁脾虛證IBS-D的實驗中采用饑飽失常+番瀉葉灌胃+強迫游泳2周的方法造模，復制肝郁脾虛證IBS-D大鼠模型。以大鼠抬腹壓力閾值、拱背壓力閾值來評估大鼠結腸敏感度，以大鼠的大體情況、糞便含水量、稀便級數、稀便率評估腹瀉癥狀的建立配合炭末推進率評估腸道動力，以兩者確立疾病；以糖水偏好指數、曠場實驗、大鼠體質量變化評估肝郁脾虛證型。此法采用多種實驗評價方法驗證，可靠性強，但文獻中并無具體操作方法，實驗復制難度大。

4.5 新生母子分離 + 慢性束縛 +番瀉葉灌胃法

趙迎盼等[17]研究了IBS-D肝郁脾虛型病證癥結合大鼠模型的建立。采用新生母子分離 2周+慢性束縛3 周+番瀉葉灌胃1周法成功復制了該模型，并進行高、中、低劑量組實驗，確定番瀉葉灌胃 0. 45 g /m L、1 m L/100 g效果最佳。造模后以結直腸擴張的疼痛閾值代表內臟敏感性以評價疾病，以曠場實驗和血清D-木糖水平評價肝郁脾虛證型的建立;以排便粒數和稀便率評價腹瀉癥狀的建立。該研究認為此三因素復合 SD 模型大鼠符合 IBS-D 肝郁脾虛型疾病特點，可能是一種較好的研究中醫藥治療 IBS 療效機制的動物模型。

張北華等[18]通過對幾種造模方法進行動物實驗對比研究表明：采用母子分離 8 周+慢性束縛應激3周+番瀉葉灌胃1周，番瀉葉煎劑( 0. 45 g/mL)灌胃( 4. 5 g/kg) 可成功建立肝郁脾虛型病證結合大鼠模型；采用慢性束縛聯合母子分離法造模優于單一因素法；內臟敏感性評價疾病、大便積分評價腹瀉癥狀的建立、曠場行為學評價肝郁脾虛證型的建立。該研究所建立的肝郁脾虛型大鼠模型具有內臟高敏感性、腸道通透性增加、抑郁和免疫功能異常等多種特征。

周云等[19]以番瀉葉水煎劑灌胃+四肢慢性束縛應激刺激每天1次、連續6 d的方法建立肝郁脾虛型IBS 大鼠模型，觀察大鼠的一般情況如體質量、糞便含水量、稀便級數評價腹瀉癥狀的建立及肝郁脾虛模型的建立，小腸炭末推進百分率評估腸道動力，血清中 5-羥色胺含量變化評價疾病的建立，大鼠模型結腸黏膜組織無明顯病理改變符合功能性腸病的改變。此法建立的肝郁脾虛型大鼠模型評價指標簡單，可重復性強，但未對腸道敏感性進行評價，是否能作為穩定的IBS 療效機制的動物模型，仍需要進一步的研究。

5 討 論

IBS-D肝郁脾虛型大鼠模型是一種具有肝郁和脾虛兩種證候特點、以腹瀉為主癥的一種非器質性疾病模型。通過查閱文獻，筆者發現由于精神心理因素在發病機制中具有重要作用。在實踐中，心理應激(慢性束縛應激)聯合夾尾刺激、番瀉葉灌胃或乙酸灌腸是最常采用的造模方法，符合中醫情志致病的理論：肝郁久犯脾，可導致脾虛。新生期母子分離作為情志刺激，也可導致肝郁。番瀉葉一般被認為是苦寒瀉下脾虛造模的首選，可致腹瀉，是中醫脾虛證的一個致病因素。因此,慢性束縛應激、夾尾刺激不僅可使大鼠內臟敏感性增高又是肝郁證造模的方法。本研究的目的即是尋找出一種最接近肝郁脾虛證本質的穩定的可重復的造模方法。

目前對 IBS-D 動物模型的造模方法尚未成熟，建立IBS-D 肝郁脾虛型病證結合動物模型的研究中依舊存在一些問題。值得一提的是，利用西醫疾病模型與中醫證候特點的單純疊加，可以更好地模擬 IBS-D 的病理特點。現有的病證結合動物模型造模方法分析，多采用束縛應激法模擬疾病特征，這種方法作用短暫，模型穩定性欠佳；建立證候模型所用造模方法缺乏公認性和普適性。通過大量的研究,需要對上述問題進行驗證和改進,使 IBS-D 肝郁脾虛證與動物模型結合起來更加成熟,充分發揮中醫藥的優勢。沒有明確的標準,就沒有合格的模型產品，因此在實踐中,應不斷摸索和完善病證結合動物模型的統一的評價方法。根據腸易激綜合征的發病機制,對動物模型的研究尚處于探索階段，全面深入地研究其發病機制對該證型造模方法具有重要意義。同時,肝郁脾虛證動物模型有助于研究該證型復方的作用機理,驗證復方的功效，進新藥開發,充分發揮中醫藥治療的優勢。