ASFV-LAMP方法在豬場非洲豬瘟排查中的實用價值及注意事項

(江山市畜牧獸醫(yī)局，324100)

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的家豬、野豬的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病，死亡率高達100%。LAMP法因其高效靈敏、價格低廉，且不需要特殊儀器等優(yōu)點，在規(guī)模豬場的非洲豬瘟排查中具有優(yōu)勢。

1 LAMP方法的特點

LAMP方法全稱Loop-mediated isothermal amplification,即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法，是2000年日本學(xué)者Notomi等報導(dǎo)的一種新的恒溫核酸擴增方法。特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在60～65 ℃恒溫擴增，能夠在15～60 min即可實現(xiàn)109-1010的核酸擴增，具有特異性高、靈敏度高、反應(yīng)時間短、操作簡單的優(yōu)點。此外，因只需在60～65 ℃恒溫擴增，需要儀器簡單成本低，且反應(yīng)產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀只需肉眼就能觀察到，因此還有鑒定方便的優(yōu)點。

2 LAMP方法與其它檢測方法的對比

目前非洲豬瘟的主要檢測技術(shù)有2大類，即基于抗原、抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法及核酸檢測方法。免疫學(xué)方法檢測因抗體只有在病毒入侵至一定時期才會出現(xiàn)，因此在對非洲豬瘟早期排查時存在局限性。而傳統(tǒng)的針對核酸的監(jiān)測方法,如PCR法相比之LAMP法則存在成本較高的問題，特別是實時熒光PCR，耗費高且難以擺脫實驗室的限制，在豬場的自我排查時難以推廣。

3 使用LAMP方法排查時的注意事項

在LAMP試驗中，最主要的缺點就是容易產(chǎn)生假陽性高。這主要是因為它的擴增產(chǎn)物本身就是模板，且反應(yīng)是在恒溫下進行的，所以如果在同一地方進行多次試驗，前面反應(yīng)產(chǎn)物所形成的氣溶膠很容易污染后續(xù)試驗，從而造成假陽性。

該問題也并非不能克制，只要操作人員在實際操作中注意一些細節(jié)，就能有效避免污染的存在。使用LAMP方法排查時應(yīng)遵循以下幾點注意事項：

一是操作時應(yīng)小心輕柔，吹打混勻溶液時不要有氣泡產(chǎn)生，避免EP管劇烈震蕩。

二是除酶制劑及不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。

三是各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。

四是實驗室要注意通風(fēng)，最好選擇超凈工作臺和生物安全柜。實驗室要定期進行清潔及紫外照射，消除潛在污染。