有機化學實驗中使用HPLC法測定4種茶中的咖啡因

張艷虎，周琢強

（華南農業大學材料與能源學院，廣東廣州 510642）

茶樹的葉子在嫩綠的時候進行加工就制成了茶葉，茶葉有多種多樣，且有很多品牌，通常有紅、綠、黑、花茶，飲茶具有明目清神的效果，對身體非常有益，有非常明顯的保健作用。茶葉含有大量嘌呤類生物堿，主要由咖啡因組成，一般含量都能達到2%～5%。咖啡因（CAF）是一種弱堿性生物堿，脂溶性強，與強光以及高溫下不具有穩定性，能夠溶在沸騰的水中、丙酮、乙酸乙酯、乙醇，非常容易溶解在二氯甲烷當中。中樞神經受到咖啡因刺激會變得非常興奮：達到增強大腦皮層興奮需要達到中低劑量（80～400 mg），降低疲勞，提神醒目，當劑量達到（≥500 mg）就能夠使興奮延腦血管運動中樞以及呼吸中樞，咖啡不僅能夠，在飲品、食品、日用化工等方面應用，同時在醫藥衛生方面的運用也非常廣泛。咖啡因的提取方式不僅可用有機合成法也可以用系統提取法。1820年，Runge第一次在可可豆和茶葉中取得，1950年中國在茶葉中取得；在1895年，Fischer運用化學合成了咖啡因，1958年，中國合成之后進行了生產。因為它們之間的晶型不一樣、精制方式也不一樣，所以，咖啡因粉的X-射線也不一樣。但升華可使合成品轉晶。運用有機化學試驗當中溶劑法取得（索氏提取，濃度為95%的乙醇），在用升華法純化即可取得。檢測茶葉中咖啡因劑量的方法較多，例如容量分析法、薄層色譜法、氣相色譜法、紫外分光光度法、高效毛細管電泳法、高效液相色譜法等。此研究依據國標GB/T 8312—2002中HPLC法對茶葉中咖啡因含量進行檢測，在有機化學實驗當中用茶葉檢測含量，同時對同學們從茶葉里取得咖啡因的數據結果予以評價。

1 設備和化學試劑

1.1 設備

數字熔點測定儀（申光牌WRS-1A），電熱恒溫水浴鍋（型號：HWS-12），可調試電砂浴（型號：DK-2），精密電子天平（廠家：北京賽多利斯 型號：BSll0S），索氏提取器，紅外分光光度計（型號：島津IR-prestige-21），儀器高效液相色譜儀（雙波長紫外檢測器，島津LC-2010 AHT）。

1.2 試藥

咖啡因對比品（自己制造的熔點測定儀進行熔點測定234.27～235.67℃），甲醇（色譜純），茶葉（綠茶 1、紅茶和磚茶、綠茶 2、）（市場銷售），純凈水，乙醇（純度為95%）。

2 方式與效果

2.1 咖啡因的取得

稱量茶葉重量10g，放在研缽里予以研碎，然后放在索氏提取器里，用75 ml濃度為95%的乙醇獲取，放在水中進行加熱，持續提取時間大概為1.5h，最后濃縮到20ml。加入化學試劑氧化鈣3～4g，之后用水蒸氣予以蒸干之后，將準備好的玻璃漏斗倒放在蒸發皿之上，但中間必須用帶小孔的濾紙予以隔離，以防出現升華現象，然后加熱至200-230℃，升華進行完以后，將其冷卻到100℃，將白色針狀結晶進行收集，進行稱量，最后測熔點。

2.2 咖啡因對比品的制備

取適量純度不高的咖啡因，置于蒸發皿當中進行更近一步的升華純化，測量其熔點，取適量咖啡因利用溴化鉀壓片測其紅外光譜。純化后的咖啡因熔點為234.27～235.67℃，和國家藥典文獻描述統一，數據庫對紅外光譜進行檢索后與咖啡因圖譜統一。

2.3 咖啡因比例的檢測

2.3.1 色譜的條件

流速：1ml/min，檢測波長：280nm，柱溫：40℃，色譜柱：Inertsil ODS-SP柱（規格 4.6 mmX150 mm，5μm），進樣量：10μm，流動相：水一甲醇（比例為 65：35）.

2.3.2 制備對照樣品溶液

準確稱量12.5mg咖啡因對照樣品，放在25ml容量瓶內，加乙醇一水（配比為 1：4）定容到刻度（500μg/m1），以備使用。

2.3.3 描畫制作標準曲線

仔細吸取對比樣品液體（500/μg/m1）1.5、1.2、0.9、0.6、0.3ml，均放在10ml容量瓶當中，然后加入純凈水到定容刻度，濃度分別為75、45、60、30、15μg/ml對比樣品溶液，然后用0.45μm微孔濾膜進行過濾。根據以上色譜要求進樣10μl，縱坐標用峰面積A表示，橫坐標代表標準咖啡因濃度C，進行描繪制作標準曲線。只要濃度在15～75μg/ml內，咖啡因和峰面積呈線性關系，相關系數y=O.9999，標準曲線方程A=24137C+35952.

2.3.4 回收率試驗

準確稱量8份（每份2.0g）茶葉（綠茶1）樣品，在當中的6份里各放進兩份高（45mg）、中（25mg）、低（10 mg）3種不一樣劑量的對比樣品，其中的2份作為本底值，根據樣品溶液取得辦法制備并且加入標準樣品溶液，根據樣本的檢測方法予以檢測。回收率的計算結果是91.90%-100.03%。

2.3.5 精確度實驗

準確吸取0.9ml對照品溶液，放在10ml容量瓶當中，然后加水進行稀釋直到規定刻度，濃度是45μl/ml，兩小時進一次樣，共需要測量五次。每天精密度計算結果為0.042%。

2.3.6 樣本測量和對比實驗結果

稱量四種茶葉的重量各10g，然后放在研缽里予以研碎，再將其放入索氏提取器當中，在其中加入濃度為95%的乙醇75 ml，放在95℃水中進行加熱，提取時間需要持續大概1.5h，濃縮以后放在100ml容量瓶里加水定容，準確吸取1.0ml，用水定容至刻度在5ml的棕色量瓶中，0.45μm微孔濾膜進行過濾然后進樣，最后測定結果。

3 探討

同學們進行的試驗當中提取率最高的分別是紅茶、綠茶2，最低的是磚茶，HPLC檢測結果與其統一。不過收率都不高，通過研究發現造成收率低的因數有兩個。第一是因為同學們試驗時在升華時沒有將溫度控制好，結晶不能全部予以收集；第二是磚茶研磨的不夠到位，因為磚茶的枝葉比較硬，也是導致提取率偏低的因素；最后在1.5提取時虹吸次數的不穩定也會造成提取率不高。同學們的實驗結果和HPLC結果進行對比，兩者的提取率都大于10%，紅外光譜檢測與收集在一起的咖啡因通過熔點檢測獲得的產物純度比較高，證明咖啡因通過有機溶劑在茶葉中提取的辦法比較成熟。

此研究依據國家標準GB/T8312—2002當中利用HPLC法檢測茶葉中所含咖啡劑量的方法，根據國準給出的色譜要求，流動相：水-甲醇（配比為 70：30），柱溫：40℃，流速：1ml/min，進樣量：10μl，檢測波長：280nm，測得結果是其它物質峰比較多的存在于綠茶2、綠茶1當中，很難完全和咖啡因峰區別開，依據高效液相色譜道理將流動相極性增大，通過數次試驗把流動相改成：水-甲醇（比例為65：35），其他條件不做改變，從而將咖啡因峰和其他物質峰進行分離在從4種茶葉里獲取樣品溶液的過程當中。在測定HPLC時，綠茶2、綠茶1都含有比較多的其它物質峰，但紅茶與磚茶就比較少。依據調查研究得出因為工藝以及原料的差異導致茶葉中成分存在不一樣的地方。茶樹新梢作為綠茶的原材料，通過反復搓擦、殺青（經過高溫予以破壞以及對新鮮葉子當中的氧化酶活性進行鈍化）、使茶葉失去水分等工藝制做而成，由于通過氧化酶滅活以后，茶葉的很多成分能夠保留在炮制過程當中，會產生紫外吸收當在280nm的紫外檢測波長之下，會出現很多物質峰。茶樹上面的新芽葉作為紅茶的原材料，通過發酵干燥等制作而形成，讓茶葉在炮制時全面氧化分解代謝，降低了產生的紫外吸收在280nm紫外檢測波長之下，就會表現出相對偏低的物質峰。