絕經后骨質疏松癥相關的LncRNA研究進展

陳桐瑩 萬雷 劉少津 柴爽 林燕平

1.廣州中醫藥大學第三臨床醫學院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣東 廣州 510375

骨質疏松癥是一種臨床較為常見的全身性骨骼疾病，可分為原發性與繼發性兩種類型，絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是原發性骨質疏松癥中最常見的一種，又稱I型骨質疏松癥。據預測，從1997年到2050年，中國的骨質疏松癥人群將從8 390萬急劇攀升至2.12億[1]。由于PMOP是一種慢性代謝性疾病，嚴重影響絕經后婦女的身心健康，給她們及家庭帶來沉重的負擔。因此研究絕經后骨質疏松癥的發病機制和探索其防治手段就顯得非常重要。傳統觀點認為PMOP的基本發病機制涉及破骨細胞的骨吸收與成骨細胞的骨形成之間的不平衡，主要是由于雌激素水平下降，繼發甲狀旁腺功能亢進，降鈣素分泌不足，從而導致骨吸收大于骨形成[2]。近年來，越來越多的研究認為遺傳因素、腸道菌群失調、氧化應激和骨髓間充質干細胞(bone marrow messenchymal stem cells, BMMSCs) 異常分化等也是絕經后骨質疏松癥發生的主要機制[3]。此外隨著對長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，LncRNA)研究的深入，發現這些LncRNA在絕經后骨質疏松癥中起著重要作用。本文將針對近年來與PMOP相關的LncRNA展開綜述。

1 LncRNA的作用機制及生物學特性

2002年日本學者Okazaki在對小鼠cDNA文庫進行測序時，第一次發現并鑒定了一類較長的轉錄產物，將其命名為LncRNA[4]。它是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，主要來源有：①編碼蛋白質的基因結構發生中斷產生；②染色質重組；③非編碼基因復制過程中的反移位產物；④局部的串聯復制子中產生；⑤基因組中插入一個轉座成分而產生有功能的非編碼RNA。而根據其在基因組上相對于蛋白質編碼基因的位置，LncRNA分為以下幾種：①反義長鏈非編碼RNA；②內含子非編碼RNA；③基因區間的非編碼RNA；④啟動子相關LncRNA；⑤非翻譯區LncRNA。另外，LncRNA可通過以下方式對基因進行調控：①表觀遺傳調控(基因組印記和X染色體失活)；②轉錄調控(LncRNA的轉錄可以干擾鄰近基因的表達，還可以作為共因子調節轉錄因子的活性)；③轉錄后調控。近年有大量研究[5]表明LncRNA在多種疾病發生、細胞周期、干細胞分化等生物進程中發揮著作用。在成骨分化過程中，也證實了分化的間充質干細胞中超過100個LncRNA被上調或下調;在對骨質疏松的研究中發現，LncRNA在Wnt/β信號通路、PI3K-Akt信號通路、BMPs/TGF-β信號通路、Notch信號通路和Hedgehog信號通路中能促進成骨細胞的分化,而在RANK/RANKL/OPG 通路、MAPK通路、PPAR-γ通路能抑制破骨細胞的分化。可見LncRNA在骨質疏松癥等骨代謝疾病的發生中起著重要作用。

2 LncRNA調節成骨細胞的分化

2.1 MEG3、DANCR和BDNF通過表觀遺傳調控調節成骨細胞分化

LncRNA 可以通過表觀遺傳調控影響成骨分化，即可通過DNA甲基化或去甲基化、RNA干擾、組蛋白修飾、染色體重塑等，在表觀修飾水平調控基因的表達。MEG3位于染色體14q9上，對于正常生長和發育很重要，其是一種特定的腫瘤抑制因子，功能是激活p53并抑制細胞增殖，并可以控制印跡基因表達。在LncRNA MEG3的早期研究[6-7]中發現其在某些癌癥中特異性地低表達。Zhuang等[8]研究成骨細胞分化過程中的MEG3功能，發現MEG3敲低可以靶向BMP4轉錄進而抑制間充質干細胞(mesenchymal stem sells,MSCs)的成骨分化。敲低MEG3會顯著降低關鍵成骨標志物Runt相關轉錄因子2、Osterix和骨鈣素的表達，過表達MEG3則會增強它們的表達；MEG3還可以通過從骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)4基因中解離SOX(sry-related HGM-box)2來阻斷關鍵轉錄因子SOX2對BMP4啟動子的激活。BMP4是轉化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)家族的成員，被認為是軟骨和骨形成的調節因子，并且其在胚胎發育、造血，組織和細胞分化增殖以及間充質干細胞發育中起非常關鍵的作用。Zhuang的實驗顯示了LncRNA MEG3可能通過控制鄰近編碼基因BMP4的轉錄調控間充質干細胞的成骨分化。Chen等[9]在BMMSCs中發現了LncRNA MEG3的一種抑制劑DEPTOR，并發現其能通過抑制MEG3介導的BMP4信號傳導活化來調節成骨分化，參與骨質疏松癥的發生。此研究結果也證明了MEG3介導的BMP4信號傳導可以正向調節成骨分化這一過程。

Zhu等[10]發現DANCR能抑制成骨分化，其通過募集 EZH2至Runx2基因啟動子，催化甲基化，導致Runx2及成骨分化被抑制。LncRNA-DANCR位于人4號染色體上，最接近的相鄰注釋基因位于USP46上游54.8 kb和ERVMER34-1 ANCR基因座下游28.7 kb。與蛋白質編碼相比，DANCR是非編碼轉錄物的可能性是7.64×1090倍。DANCR參與了祖細胞的分化。此外，DANCR調節成骨細胞分化，是成骨細胞分化的重要介質[11]。而Xiang等[12]在探索LncRNA與人類骨質疏松癥相關的循環單核細胞中的作用的實驗發現，DANCR在有骨吸收活動循環單核細胞中能促進IL-6和TNF-α的表達。首先，循環單核細胞直接參與破骨細胞生成，它們是破骨細胞的前體，并且還分泌骨誘導因子，例如IL-1、IL-6和TNF-α[13-14]。其次，細胞因子IL-6可以促進造血和破骨細胞生成，骨和骨髓基質細胞產生的IL-6在體外被17β-雌二醇抑制。因此，雌激素的損失導致IL-6介導的破骨細胞生成刺激，這也是絕經后骨質疏松癥中骨吸收增加的機制[15]。另外過度表達人類TNF的轉基因小鼠除了糜爛外還會發生全身性骨質流失和骨質疏松癥[16]。由此可知DANCR可能在骨質疏松癥的病理機制中發揮重要作用。

反義LncRNA可以通過招募形成染色質修飾復合物而沉默鄰近基因轉錄，例如BDNF。Xiao等[17]在卵巢切除(OVX)小鼠的實驗中發現OPN和Runx2(兩者均為成骨標志物)被長鏈非編碼RNA BDNF-AS(腦源性神經營養因子-反義轉錄物)下調，而被BDNF上調。Xiao等評估了在成骨分化期間OVX衍生的BMMSC中BDNF-AS的動態變化，發現BDNF基因和蛋白的下調支持了BDNF-AS和BDNF在成骨分化中是錯綜復雜且反向相關的。OPN和Runx2的下調可能有助于解釋BDNF-AS上調抑制或降低BMMSCs的成骨分化。該實驗證明了BDNF在調節BMMSC的分化中起著重要作用，同時還發現了一種新的信號通路BDNF/BDNF-AS，它參與了BMMSCs的成骨分化。

2.2 H19通過競爭性內源RNA促進成骨細胞分化

LncRNA可通過競爭性結合有限的miRNA特定位點控制其他RNA包括編碼 RNA的水平。因此學者們提出了競爭性內源性RNA的假說，認為mRNA、假基因轉錄物、LncRNA等轉錄物與miRNA具有相同的應答元件(miRNA responseelement，MRE)，通過競爭性結合同種miRNA來調控各自的表達水平，從而影響細胞的功能。LncRNA-19位于人類11號染色體上，H19是最著名的印記基因之一，僅從母系遺傳的等位基因轉錄。Huang等[18]在研究H19/miR-675在人間充質干細胞(human mesenchymal stem sells，HMSCs)成骨分化中的作用和功能的實驗中證明H19是細胞水平成骨分化的正向調節劑。Huang等還發現H19可通過轉化生長因子(TGF)β1/Smad3蛋白/組蛋白(HDAC)信號通路來促進HMSC的成骨分化。隨后，Fu[19]證明H19可通過競爭性內源RNA促進成骨細胞分化。最近，Li等[20]研究H19在廢用性骨質疏松癥(disuse osteoporosis, DOP)發病機制中的生物學功能時發現敲低H19能抑制Wnt信號傳導和成骨功能，這與H19可能干預Wnt/β連環蛋白信號傳導途徑(Wnt信號)，從而發揮調節骨形成和參與成骨細胞分化有關。Li等的研究為H19正向調節成骨功能提供了實驗證據。他們還進一步研究發現了Dkk4是H19的潛在靶向基因，研究中H19的表達減少會促進Dkk4表達。而Dkk家族(Dkk4)已報道在成骨細胞中發揮負向調節作用，Dkk4在成骨細胞中可以抑制Wnt信號傳導。此發現亦可間接證明H19可促進成骨分化。

2.3 MEF2C在轉錄后水平調節成骨分化

肌細胞增強因子(musculocyte enhancement factor, MEF)2家族轉錄調節因子MEF2C在成熟的骨髓和外周成熟B細胞中高度表達[21]。MEF2C的遺傳缺失會削弱軟骨血管生成、骨化和縱向骨生長。相反，超活化的MEF2C則能導致早熟的軟骨細胞增生、生長板的骨化[22]。MEF2C-AS1是一種反義LncRNA。Qin等[23]通過研究單個LncRNA多態性，發現MEF2C-AS1 rs6894139與FN(股骨頸)骨密度(bone mineral density, BMD)相關，而LOC100506136 rs6465531與HIP(腰椎和全髖)BMD相關。Li等[24]發現小鼠BMD定量性狀基因座定位于MEF2C-AS1區域。信號、誘餌、導向、框架是LncRNA生物學效應的形式，以上實驗可證明LncRNA MEF2C-AS1可影響MEF2C表達或翻譯，特別是其二級結構間接影響軟骨內骨發育。這些研究發現意味著MEF2C-AS1 rs6894139、LOC100506136 rs6465531在骨代謝中的潛在作用，為絕經后骨質疏松癥提供了更多的研究方向。

2.4 LINc00963、LOc105376834、LOc101929866、LOc105374771和LOc100506113

隨著技術的進步，從單個基因位點的分析已經擴大到LncRNA與mRNA的網絡構建分析。Qi等[25]在骨質疏松患者的RNA 測序研究中發現了差異表達的LINc 00963、LOc105376834、LOc101929866、LOc105374771和LOc100506113明顯下調，他們建立了EnncRNA-DEmRNA共表達網絡，此表達網絡能反映出LncRNA與mRNA之間的正相關性。同時檢測到差異表達的mRNA堿性磷酸酶(ALPL)、細胞因子信號轉導抑制因子3(SOcS3)、腎上腺髓質素(ADM)、分泌性白細胞肽酶抑制劑(SLPI)和CD177均明顯下調。在下調的LncRNA中，LOc105374771是最顯著下調的LncRNA，其與130個dEmRNA共表達，包括ALPL、SOCS3、ADM、CD177和SLPI。故LOc105374771可能通過調節這些dEmRNA的表達來影響PMOP的發病。已知ALPL是一種成骨細胞標志物，下調的ALPL可以反映成骨細胞活性降低、骨形成和細胞外基質礦化。以往的研究也已經檢測到PMOP患者和卵巢切除小鼠骨組織樣本中的ALPL下調。而SOCS3升高轉化生長因子-β、TNF-α和RANK配體(RANKL)誘導的破骨細胞形成，并通過抑制劑促進破骨細胞譜系的前體。SOCS3還通過調節相關細胞來參與RANKL介導的樹突細胞衍生的破骨細胞生成。ADM與調節骨形成密切相關。可以在體外促進軟骨細胞和成骨細胞的生長[26]。此外，ADM可以減少血清饑餓的成骨細胞中的凋亡細胞死亡。CD177是PMOP中第三個重要的DEmRNA，也可能是雌激素相關基因。由此可以得出，LINc00963、LOc105376834、LOc101929866、LOc105374771和LOc100506113與以上五種DEmRNA的共同表達可能提示這些差異表達的LncRNAs參與了PMOP的發病。

3 LncRNA調節破骨細胞的分化

3.1 LncRNA AK077216通過轉錄調控促進破骨分化

LncRNA可以依賴與靶基因的相對位置及序列特點，如通過將轉錄調控因子募集到鄰近的靶基因啟動子上的方式，在轉錄水平上調控靶基因的表達。Liu等[27]在LncRNA AK077216對破骨細胞生成和骨吸收作用的實驗中發現，LncRNA AK077216 促進了破骨細胞分化并增強破骨細胞骨吸收。具體通過抑制活化T細胞核因子蛋白(nuclear factor of activated T cell interacting protein，NIP)45并提高NFATc1的表達來促進RANKL誘導的破骨細胞生成和骨吸收。核因子κB配體(RANKL)可以通過激活MAPK和NF-κB途徑誘導破骨細胞生成轉錄因子(c-Fos和NFATc1)的表達,進而影響破骨細胞的分化。而活化的NFATc1反過來可以調節破骨細胞特異性基因的表達，例如編碼抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、基質金屬蛋白酶和組織蛋白酶K(CTSK)的基因，這些基因參與破骨細胞骨吸收[28]。故NFATc1是破骨細胞生成過程中的一種必需的轉錄因素。而在先前的實驗中[29]發現在RANKL刺激的前破骨細胞中敲低NIP45的表達會增加NFATc1、NFATc2和TRAF6的水平，這表明NIP45通過抑制NFATc1表達負調節破骨細胞分化和骨吸收。Liu等的實驗中生物信息學分析表明NFATc1和NIP45可能還具有負調控關系。由此發現了Lnc-AK077216作為一種調節破骨細胞形成和功能的LncRNA，同時抑制破骨細胞前體細胞凋亡，為開發由破骨細胞骨吸收活性變化引起的各種骨科疾病的新療法提供了新思路。

3.2 LncRNA LINC00311通過Notch信號通路影響破骨分化

當Notch信號通路增強，骨質疏松癥患者骨細胞的增殖和分化可能增加[30]。Delta-like 3(DLL3)是目前僅在哺乳動物中被鑒定的位于Notch信號通路中的分歧配體和調節劑，其表達的變化與成骨誘導有關，還能夠通過Notch2促進破骨細胞生成[31-32]。DLL3還是一種脊柱發育不良/矮胖基因，其突變可能導致軸向骨骼缺陷和脊柱骨質疏松癥[33]。Wang等[34]通過實驗研究LncRNA LINC00311與Notch信號通路及DLL3三者之間的關系，發現LncRNA LINC00311通過Notch信號通路靶向影響DLL3，促進骨質疏松大鼠破骨細胞的增殖和分化，實驗證明了LncRNA LINC00311靶向調控DLL3。當LncRNA LINC00311上調時，DLL3表達下降，而下調的DLL3可以通過激活Notch信號傳導途徑來促進破骨細胞的增殖和分化，同時抑制破骨細胞的凋亡。Notch信號通路的發現有助于促進對骨質疏松癥機制的現有理解，并有可能作為未來治療骨質疏松癥的預后標志物。

4 LncRNA調節細胞信號通路的激活

骨代謝的平衡有賴于骨形成與骨吸收的協調統一，這一過程既需要細胞間的信息交流，也需要細胞內多條通路的交互作用及信號轉導。既往針對骨代謝的研究已發現多條通路，如Wnt/β-catenin通路、MAPK通路、Toll樣受體通路等可以被自分泌或旁分泌的信號分子如Wnt蛋白、硬化蛋白以及雌激素、糖皮質激素等激活或抑制。近年來研究[35]發現LncRNA可以作為信號分子參與信號通路對細胞生命進程的調控。例如LncRNA-H19通過直接激活Wnt/β-連環蛋白途徑來增強骨生成[19]；H19下調可通過抑制ERK信號傳導而抑制骨形成[36]；LncRNA LINC00311可通過Notch信號通路靶向影響DLL3促進骨質疏松大鼠破骨細胞的增殖和分化[34]。而最近Tang等[37]使用定制的微陣列在成骨分化的第0天和第10天確定了BMMSC中的LncRNA表達譜,并確認了一個新的成骨相關的LncRNA(LncRNA-OG)，此基因在成骨分化過程中被上調，并顯示LncRNA-OG在體外顯著促進BM-MSC骨生成。LncRNA-OG與異質核核糖核蛋白K(hnRNPK)蛋白相互作用可以調節骨形態發生蛋白(BMP)信號通路激活,hnRNPK通過促進LncRNA-OG啟動子的H3K27乙酰化來正向調節LncRNA-OG轉錄活性。這種新的LncRNA對BM-MSC成骨分化具有積極作用，Tang等還提出了hnRNPK和LncRNA-OG相互作用可以調節骨形態發生蛋白(BMP)信號通路激活并促進成骨分化的觀點。另外Li等[38]發現LncRNA-Bmncr通過維持細胞外基質蛋白纖維調節素(FMOD)和BMP2通路的激活來調節BMSCs的成骨分化Bmncr，它在衰老過程中可以調節BMSCs的命運。Bmncr(Bmncr-KO)缺失的小鼠顯示骨量減少和骨髓脂肪堆積，而Bmncr(Bmncr-Tg)的轉基因過表達減輕了骨丟失和骨髓脂肪積累。且有進一步的分析表明，Bmncr可作為促進TAZ和ABL相互作用的支架，從而促進TAZ和RUNX2/PPARG轉錄復合物的組裝，促進成骨和抑制脂肪生成。這些研究將為防治絕經后骨質疏松癥提供一種新方法。

5 展望

絕經后骨質疏松癥是一種全身代謝性骨病，由體內雌激素水平降低引起，會極大地影響老年女性的生活質量，國家也需要投入大量的防治費用。筆者認為，對絕經后骨質疏松癥的預防和靶向治療是可行的一種防治思路，而LncRNA是機體中一個龐大復雜的調控網絡體系的一部分，其主要是通過對相關基因、蛋白和信號通路的相互作用、相互影響參與各種生理病理活動。可以通過深入研究LncRNA對疾病的精確調節機制，為骨質疏松癥等代謝性疾病的診治尋找新的治療靶點。而且現有研究對LncRNA的探索已經擴大到對miRNA、mRNA與LncRNA的網絡關系研究層次，研究水平也慢慢從細胞和動物實驗轉移到臨床研究。筆者認為在對絕經后骨質疏松癥相關LncRNA的研究中，可以從核酸、蛋白、信號通路等方面找尋目標LncRNA所參與的分子生物調控網絡，有針對性地進行精確干預，為絕經后骨質疏松癥的防治提供一種新的科學的解決方法。