鈣網織蛋白在腫瘤發生發展中的作用研究進展

唐香玲 魏浩然 周建文 唐自沁 張 錚 易 嵐

南華大學衡陽醫學院生物科學與生物技術系，湖南衡陽 421000

鈣網織蛋白（calreticulin，CRT）是一種內質網Ca2+結合伴侶蛋白，在細胞的生理及病理過程中發揮著許多功能。近年來相當多的證據表明CRT 與腫瘤的發生發展密切相關，我們將從腫瘤細胞中CRT 的表達與易位；CRT 對腫瘤細胞增殖的影響；CRT 參與腫瘤細胞的粘附、侵襲、遷移；CRT 與腫瘤細胞分化；CRT 與腫瘤細胞凋亡；CRT 與腫瘤細胞吞噬；CRT 可以作為一種潛在的癌癥診斷分子標記物等方面進行綜述。

1 CRT的表達、結構和功能

1974 年，CRT 首次被鑒定為一種存在于肌質網中的Ca2+儲存蛋白。然而，一系列的研究表明CRT 在非肌肉組織中含量也很豐富。CRT 的結構在進化中是高度保守的，主要由三個結構域組成：N 結構域、P 結構域和C 結構域，C 結構域含有一個內質網滯留信號的四肽KDEL，N 末端包含信號肽，每個結構域都有相對應的功能。CRT 的生物學功能是嚴格地由氨基酸序列決定的穩定的空間結構來限定的，CRT 也含有固有的無序區域，其結構上表現出的高度動態構象特征是通過為響應各種環境信號而發生幾種亞穩態構象之間的不斷變化實現的。在金黃色釀膿葡萄球菌及副溶血性弧菌中，CRT 似乎參與抗細菌免疫反應。在矮牽牛花異常伸長的花粉管中，CRT 基因轉錄后的表達沉默改變了ER 的定位和使ER 結構紊亂，最后導致細胞質流動受到抑制，大多數花粉管破裂[1]。在中華絨蝥蟹中，CRT 在鰓、肝胰腺、血淋巴細胞及腸中表達，且表達水平受脂多糖類、肽聚糖類影響。哺乳動物的CRT 是一種存在于內質網內外的46 千道爾頓的凝集素樣的分子伴侶蛋白。在內質網腔中，CRT 起著調控細胞內Ca2+穩態、氧化應激反應、分子伴侶及凝集素結合反應，參與確保新合成的蛋白質的正確折疊及糖蛋白的形成的作用[2]。CRT 也被發現存在于內質網區域外，包括細胞器及細胞外基質中。細胞表面的CRT 可以調節細胞的粘附力、細胞的相互作用、細胞轉移、吞噬、整合素依賴的Ca2+信號及免疫反應，同時在細胞增殖、分化及凋亡中起著重要作用[3]。另外，CRT 也被發現存在于細胞毒性T 淋巴細胞及精子的頂體泡的核被膜、核及核仁樣的結構中。CRT 的異常與許多疾病是相關聯的，CRT 調控一系列的細胞病理反應過程，例如傷口愈合、纖維癥及癌癥。近來研究結果表明CRT 在腫瘤的形成及發展過程中起重要作用[4]。突變特異性的免疫組織化學方法已經證實骨髓增殖性腫瘤中的CRT 發生了突變，CRT 是骨髓增生性腫瘤中第二個最頻繁的突變，它們都在C 端結構域中產生一種反復的移碼，影響CRT 的定位和鈣結合功能[5]。在30% 的原發性血小板增多癥和骨髓纖維化患者中也存在鈣網蛋白CRT 基因發生移碼突變[6]。

2 腫瘤細胞中CRT的表達與易位

在哺乳動物中，CRT 的表達水平在各種器官和組織中顯著不同，表明CRT 在每種細胞類型中發揮著不同作用。鈣網蛋白在哺乳動物中表達普遍較低，但在一些癌癥中卻表達上調。采用蛋白質組學技術發現CRT 在食管癌和乳腺癌中表達上調[7]。采用免疫組織化學檢測79 例胃癌患者中，發現53例高表達CRT。此外，CRT 的表達與腫瘤大小和向遠處轉移的發展呈正相關。肺癌患者血清CRT 濃度高于健康人，肺癌細胞膜CRT 水平更與腫瘤病理分級有關。用7，8- 二乙酰氧基-4- 甲基香豆素及二烯丙基二硫化物（DADS）等處理癌細胞可以影響CRT 的表達。同時，多種試劑如漢黃芩素和蒽環霉素等也可影響CRT 在腫瘤細胞中的定位。鈣網蛋白轉位的機制至今尚未完全闡明，CRT 通常不存在于癌細胞的ER 腔中，而是存在于乳腺癌和急性髓性白血病細胞的細胞表面。最近研究提出一種CRT 膜易位的機制，在凋亡應激條件下，CRT 的胞漿濃度上升，并通過鈣離子與細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（PS）結合。PS 的分布受氨基磷酸脂轉位酶（APLT） 的調節，它將PS 維持于細胞膜的胞漿面。凋亡過程中，在CRT 升高的同時，NO 濃度也顯著性上升，而氨基磷酸脂轉位酶對氧化還原修飾敏感，其巰基可被活性氮自由基修飾而喪失活性，氨基磷酸脂轉位酶的失活將導致PS 重新分布，部分PS 從胞漿面外翻到細胞膜外側面，從而將與其結合的CRT 帶到細胞膜的表面。

3 CRT對腫瘤細胞增殖的影響

CRT 的表達水平深刻地影響腫瘤細胞的增殖。CRT 已被證明具有抗血管生成活性，促進腫瘤淋巴細胞浸潤和抑制腫瘤生長的作用。CRT 高表達可上調胎盤生長因子PIGF 與VEGF mRNA 與蛋白的表達，而沉默CRT 對PIGF 與VEGF 的表達沒有影響，表明CRT 可通過上調PIGF 與VEGF 促進胃癌細胞增殖[8]。在胰腺癌細胞中，CRT 以MEK/ERK途徑依賴性方式調節細胞增殖和其他行為，CRT 與MEK/ERK 通路之間的相互作用可為腫瘤治療提供新的思路。另外，研究發現過表達CRT 的膀胱癌J82 細胞具有更強的細胞增殖、遷移和粘附能力而CRT 的敲除抑制了J82 膀胱癌細胞的增殖。類似地有，CRT 的過表達抑制NB 細胞系stNB-V1的增殖[9]。TSP 處理與CRT 過表達的組合顯著抑制MCF-7 細胞異種移植物的生長。將鈣網蛋白靶向連接纖維連接蛋白可導致腫瘤生長遲緩[10]。而siRNA 介導的CRT 表達敲除卻顯著抑制DADS 處理的HL-60 細胞的增殖。近來研究發現在S100A8和S100A9 粒細胞中，S100A8/9 介導的對增殖相關的Akt 和Erk1/2 信號通路的抑制可通過CRT 突變依賴的tlr4 基因阻斷而降低[11]。此外，CRT 易位和突變表達也影響腫瘤細胞增殖。在AML 細胞中，細胞內CRT 易位至細胞表面，表明其在腫瘤抑制中起作用。綜上所述，CRT 與腫瘤的增殖密切相關。

4 CRT參與腫瘤細胞的粘附、侵襲、遷移

CRT 過表達與細胞粘附增加有關，這些變化可能是由CRT 介導的來自ER 中的由于鈣粘素/ 連環蛋白系統和蛋白酪氨酸激酶/ 磷酸酶活性變化的Wnt 信號通路造成的。血小板反應蛋白（TSP）的抗粘附活性由細胞表面CRT 的N 端結構域介導，TSP通過與細胞表面CRT 的17 ～ 35 個殘基（hep Ⅰ肽）結合誘導局灶性粘連的發生，結合到低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP 1）共復合物的TSP 1 的N 端結構域抑制細胞粘附并通過粘著斑拆卸增加細胞運動。CRT 也參與了癌癥侵襲和遷移進展。對J82膀胱癌細胞進行CRT 敲除抑制來研究細胞遷移和粘附情況，發現進行CRT-RNAi 的 J82 膀胱癌細胞與對照細胞相比細胞明顯變小且細胞在體內肺和肝臟的轉移位點明顯減少[12]。與CRT 基因敲除細胞相比，在CRT 過表達的人胃癌細胞株AGS 中細胞遷移率提高，提示其可能是本病重要的治療靶點。CRT 還可通過NRP1（神經纖毛蛋白-1）調控食管癌細胞遷移和侵襲[13]。此外，CRT 過表達促進胃癌細胞血管生成和遷移，這與CRT 和胃癌微血管密度、腫瘤浸潤及淋巴結轉移的關系是一致的。在食管鱗癌細胞中，研究顯示siRNA 介導的CRT 敲除導致細胞遷移、侵襲的能力受損。CRT 還影響癌細胞間的相互作用。CRT 通過調節Slug/E- 鈣粘素途徑來調節上皮間充質細胞轉型，提示CRT 在上皮細胞與其他細胞間相互作用中的一種新功能。在腫瘤內皮細胞中，CRT 過表達導致白細胞- 內皮細胞相互作用及淋巴細胞浸潤到腫瘤中的效應增強。綜上所述，CRT 影響著腫瘤細胞的粘附、侵襲、遷移能力。

5 CRT與腫瘤細胞分化

CRT 在細胞分化中起著重要作用[14]。CRT 在去分化脂肪肉瘤細胞中高表達，在通過siRNA 介導的CRT 的下調實驗研究中發現去分化脂肪肉瘤細胞的成脂和細胞增殖的減少。因此，在分化的脂肪肉瘤中CRT 的異常表達涉及細胞去分化和腫瘤的發生。在細胞分化過程中，CRT 基因導入H9c2 大鼠心肌細胞顯著抑制蛋白激酶B/Akt 信號轉導，表明CRT 在心臟分化中起重要作用。CRT 缺陷小鼠和轉基因小鼠的研究顯示CRT 可能是鈣依賴通路的上游調節者，控制著細胞分化和器官的發育。其他研究表明CRT 可能是小鼠骨髓源性肥大細胞的分化和功能的重要調節者[15]。此外，有多份報告表明，調控CRT 表達水平對神經瘤細胞分化有深刻的影響。例如，在神經母細胞瘤（NB）研究中，我們發現CRT 是一種新的mycn（NB 的生物標記物）抑制因子，通過下調mycn 啟動子活性和蛋白表達來調節神經元分化[16]。同時，CRT 過表達促進stNB-V1 細胞的分化，血管內皮生長因子A 也參與了與CRT 相關的NB 細胞分化[17]。另外研究發現，c-jun-NH（2）激酶-CRT 依賴通路是Notch 信號阻斷誘導神經元分化所必需的。在研究生理造血過程中，我們發現CRT 在正常造血分化調節中起著重要作用，CRT 的過度表達可以通過促進紅細胞和巨核細胞的分化來影響生理造血。從細胞表面釋放出來的血管抑素（CRT 的N端結構域）已經被證明對髓系細胞的分化和骨髓微環境的血管化有影響。因此，CRT 對血管及血細胞的分化有重要的影響。此外，硝基藍四唑胺（NBT）測定顯示在CRT 過表達細胞組中NBT 的減少受到抑制，CRT siRNA 組中NBT 的減少得到增強，明顯支持CRT 在DADS 處理的HL-60 細胞的分化中的作用[18]。綜上所述，CRT 在腫瘤細胞分化中起著重要作用。

6 CRT與腫瘤細胞凋亡

有許多研究表明CRT 在腫瘤細胞凋亡的調節中起作用。用CRT 轉染的人乳腺癌MCF-7 細胞對細胞凋亡的敏感性明顯高于對照組細胞，在MCF-7和MDA-MB-231 細胞中CRT 過表達顯著促進細胞凋亡，這表明CRT 可以觸發腫瘤細胞死亡的新機制。此外，在可以導致體內免疫反應的吞噬細胞增多癥中，蒽環類藥物治療、電離輻射或光動力療法通過激活先天性和適應性免疫反應導致免疫原性的腫瘤細胞死亡。腫瘤細胞中，CRT 易位到細胞膜產生“eat me”的信號，從而促進抗凋亡細胞的清除反應，導致腫瘤細胞死亡。例如，CRT 與Fas 配體（FasL）結合并抑制Fas/FasL 介導的Jurkat T 細胞凋亡。在缺血性中風的早期階段，CRT 的增加也抑制了Fas/FasL 介導的神經元細胞凋亡，這表明它在缺血再灌注損傷后不久可能具有保護作用。CRT還可通過誘導應激反應促進腫瘤細胞凋亡。例如，在用蛋白酶體抑制劑硼替佐米（bt）治療的人膠質瘤細胞株凋亡中發現，在各種應激條件下，R-CRT與應激顆粒（SGS）結合或轉位到質膜上，參與促凋亡信號傳導[19]。玉米赤霉烯酮（Zearalenone）可通過誘導ER 應激誘導人白血病細胞HL-60 和U937的凋亡。除此之外，CRT 還可通過干預主要組織相容性抗原分子及裝配因子的加工折疊，影響抗原遞呈細胞，促進吞噬細胞對腫瘤的攝取和吞噬，加速腫瘤細胞的凋亡。由此可見，CRT 與腫瘤細胞的凋亡密切相關。

7 CRT與腫瘤細胞吞噬作用有關

人腫瘤細胞表面高表達的CRT 可以充當一種促吞噬信號。細胞表面CRT 將促吞噬細胞信號傳遞至巨噬細胞，并且它已被證明是巨噬細胞吞噬的重要調節因子[20]。有研究表明，利用組織轉換、腫瘤免疫監測和造血干細胞模型，使巨噬細胞檢測和識別合適的具有調節巨噬細胞介導的程序性細胞清除（PrCR）的亞基聚糖位點的靶細胞，從而發揮程序性細胞清除反應。CRT 作為一種“危險信號”，在表達CRT 的白血病小鼠中觀察到了強效免疫介導的對AML 的控制或排斥反應，結果表明其促進了與誘導白血病特異性T 細胞免疫相關的宿主Ⅰ型干擾素反應。CRT 暴露在細胞表面對化療誘導的免疫原性細胞死亡是必不可少的，只激活自噬而不引起ER 應激的化療藥物不能增加Eco-CRT。因此，聯合使用自噬激活劑和ER 應激誘導劑可以有效地促進CRT 向質膜的易位[21]。在MCF-7 和MDA-MB-231 細胞中CRT 的過表達對自噬沒有影響，但值得注意的是，TSP 處理和CRT過表達的組合顯著誘導MCF-7 異種移植物中的自噬。此外，體外重組TcCRT 的黑素細胞，可以促進人C1q 的摻入和巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用。CRT 還可以為DC 或其他APC 提供促吞噬信號，且CRT 可以作為免疫佐劑，將自身和TAA 轉移到細胞表面，誘導特異性的抗腫瘤免疫反應[22]。CRT 的磷脂結合位點是凋亡細胞上CRT 在細胞表面表達的關鍵錨點，并且CRT 充當PS 橋接分子，與其他PS 結合因子協同以促進凋亡細胞的吞噬作用。總之，CRT 在腫瘤細胞吞噬中發揮著重要的作用。

8 CRT可作為一種癌癥診斷分子標記及抗癌治療靶標

CRT 可以作為生物分子標記去預測及治療相關的免疫反應。在某些條件下，CRT 既是一種潛在的可能有助于檢測惡性OSCC 細胞表型的生物標志物，又是一種可以作為肺癌診斷和預測的分子標記。多因素分析表明CRT 的表達是晚期NB 患者的預測因子[23]，尿道膀胱腫瘤的CRT 對膀胱尿路上皮癌細胞的診斷具有重要作用。CRT 表達水平的改變可能影響膀胱癌在體內外的發展階段，對CRT 進一步的研究可能對發現用于癌癥化療的新的藥物靶標是有效的。例如，CRT 與MEK/ERK通路相互作用可能為胰腺癌的基因靶向治療提供新的方法[24]。MHC CIITA 主要調控MHCII 類分子的表達，也誘導Ⅰ類分子的表達，攜帶CRT/E6的CIITA DNA 與Ii-PADRE DNA 的組合疫苗在臨床使用中表現出潛在的抗腫瘤作用。另外，CRT的暴露可增加腫瘤細胞的免疫原性。例如，攜帶有人CRT-E6-E7-L 2 DNA 的疫苗誘導了一種具有潛在的E6/E7 特異性的CD8+T 細胞免疫應答反應，從而對持續表達E6/E7 的腫瘤細胞造成明顯的治療效果。在新的研究中，攜帶有CRT/E7 的pNGVL4a 疫苗對處于HPV16+CIN2/3 期的患者有良好的耐受性和較高的免疫應答[25]。通過對小鼠的實驗研究發現DC 細胞封鎖或拆卸CRT 可以抑制被蒽環類抗生素處理的腫瘤細胞的吞噬作用及免疫原性。這些數據表明CRT 可以為抗腫瘤免疫反應及免疫原性化學治療提供可能的策略。同時，CRT 可以作為多種腫瘤的分子標記，甚至可以成為腫瘤治療的靶標。

綜上所述，CRT 與腫瘤的增殖、分化、凋亡、遷移、吞噬密切相關，可以作為一種潛在的癌癥診斷分子標記及抗癌治療靶標。