口蹄疫免疫抗體Elisa試驗注意事項

哈爾教·莫加西

（新疆哈密市巴里坤縣畜牧獸醫工作站 839200）

1 口蹄疫危害

口蹄疫是由口蹄疫病毒感染而誘發的以口蹄部出現水皰癥狀為典型特點的傳染性疾病，此病典型特點是傳播速度快，發病病程急。目前，傳染除被污染物感染后還能以氣、溶、膠的形式通過空氣長距離傳播。此病危害較大，發現不及時，診斷不到位將會造成慘烈局面。

2 口蹄疫診斷

考慮到口蹄疫帶來的危害，準確診斷此病對及時遏制病情擴散意義顯著。目前，效果顯著的診斷方法是通過檢測動物體液中 (主要是血清) 特異性抗體，可對FMD 病毒感染與免疫狀況做出診斷，通常采用Elisa 方法，該診斷方法也是國際貿易中指定方法。FMD 病毒抗體檢測可用于以下幾個目的：（1）診斷急性感染，用同一試驗檢測急性期和康復期豬血清樣品，血清抗體陰轉陽或抗體滴度急劇上升表示發生了感染，但診斷的前提是豬無疫苗接種史；（2）證實豬未被感染，用于國際貿易；（3）在流行病學調查中檢測感染情況；（4）支持疫病撲滅計劃和后期檢測；（5）接種疫苗后效價測定。值得提示的是，免疫豬有時抗體滴度很低，甚至檢測不到抗體，但攻毒后仍能保護[1]。

3 口蹄疫免疫抗體Elisa試驗注意事項

3.1 試劑需回溫處理

試驗過程中試劑在用之前都要經回溫處理。尤其冬春季節，溫度較低充分回溫很重要。同時，室溫孵育期間，注意溫控、光照、通風等，保證在恒溫狀況操作。反應板上加樣后，務必及時加蓋封板膜，避免水分過多散失影響試驗結果。此外，孵育箱內放置的反應板不要疊加放置，避免受熱不均勻。

3.2 不混用不同批次試劑盒成分

為確保試劑試驗結果準確，不同批次試劑盒試劑成分都要經過優化處理，同時要避免不同批次不同試劑成分的混合使用。

3.3 規范樣品稀釋、加樣、轉移等操作流程

加樣用樣品的稀釋，應先加稀釋液，后加待檢血清。

加樣期間，所加物應加注到Elisa 板孔底部，不要黏附在孔壁上。板孔內液體輕輕搖晃，不要將液體濺出孔外，更不要產生氣泡，避免有弱陽性樣品顯假陰性[2]。

注意移板順序，通常是將反應U 型板抗原抗體混合液向Elisa 板轉移。而不是將Elisa 板抗原抗體混合液向U 型板轉移。移板的目的是將U 型板抗原抗體混合液有效轉移到包被了FMD型特異性抗體的Elisa 板上繼續進行酶促反應。移板應從稀釋倍數高的板孔開始，每移一次孔更換一個槍頭。

3.4 嚴格控制好溫育時間

Elisa 反應試驗期間，一般要經過加標本和加酶結合物后的兩抗原抗體反應。為確保反響質量和效果，必須要恒定一定的溫度和時間，這個過程為溫育。日常操作實踐過程中，習慣將微量板放置溫箱內開始算升溫計時。但實際上微量板升溫到37℃就要有10min，那么實際測量的溫育時間應推遲10min，也就是控制在70min 為宜，這樣才能確保達到預想的升溫效果。

3.5 病毒抗原放置時間不能過長

大量試驗結果證實，使用病毒抗原時間過長，反應試驗過程中OD 值將嚴重偏低，影響OD 值的準確性，會出現假陽性情況。為此，使用的病毒抗原務必不能超過半年以上。

3.6 Elisa底物緩沖液要做到現配現用

試驗用底物溶液，配好后為無色。使用的底物緩沖液最好現用現配，因為在儲存過程中很容易長霉菌，甚至產生很多雜質，干擾試驗。ABTS 底物不能暴露在強光下，而且對污染物非常敏感，因此，強烈建議顯色液現用現配。如果經常實驗，可以考慮配制ABTS 母液，配制濃度需要參考其溶解度和稀釋、分裝方便綜合確定 （以一次試驗用完一個分裝瓶為好）。配制并分裝好后，密封，外包裹錫紙，4℃保存。注意配制過程中嚴防污染。

3.7 準確把控好終止液的加入時間

在Elisa 試驗過程中，當酶聯合反應結果出來后，殘留酶標液還會繼續與顯色劑反應，此時為終止反應，以免影響實驗結果，應及時加入終止液。終止液的使用與底物液的加入順序一致。當底物反應時間到后應立即加入，避免影響試驗結果。

3.8 酶標儀讀數前要預熱0.5h

后期試驗結果測定，在酶標儀讀數期間應注意幾個問題：微孔板底部注意清潔衛生，做好酶標儀濾光片的沖洗。同時，注意預熱0.5h 后讀數，這樣能確保測量數值的準確。

4 結論

Elisa 法的提出大大便捷口蹄疫診斷。體現出來的優點表現為簡單操作、靈敏度高、特異強；實驗穩定性高，結果穩定。但試驗過程中務必要做好每一環，否則會出現陰性、陽性及病毒液對照孔不成立等問題，影響試驗結果。