豬瘟單克隆抗體診斷技術的推廣與應用

麥麗芳

（廣東省惠州仲愷高新技術產業開發區農業技術服務中心 516006）

1 單克隆抗體的主要作用

20 世紀初期，細胞融合技術得到第一個單克隆抗體，單抗的問世為各種病害的診斷、預防和治療提供了強有力的技術措施。經試驗比較可以發現，單抗純度高、活性單一，與抗原結合后能無限繁殖，形成強的特異性，可識別多種新型表位，可識別抗原等優點，在治療性候選藥物及診斷試劑盒開發中發揮關鍵性作用。

2 豬瘟疫情介紹

2.1 流行病學

豬為豬瘟唯一易感群體，致病病毒可隨糞便、分泌物等排到體外，散布在外界形成傳染載體。近些年，典型豬瘟病例漸少，而非典型性豬瘟占大多數。臨床表現持續感染，隱性傳染，混合感染。妊娠母豬感染，多數癥狀不突出。但會伴發明顯的繁殖障礙病。

2.2 臨床癥狀

急性：發病急，高熱稽留，突然發病。多數發病后 1～2d即可死亡。此病流行初期便秘，后期下痢。檢查排出糞便有大量血絲或黏液。個別病例伴發典型神經癥狀。

慢性：臨床以纖維性壞死性腸炎為典型癥狀，癥狀較急性類似，但癥狀時好時壞。可見癥狀食欲不振、貧血、消瘦，便秘與腹瀉交替出現，皮膚有大小不等的壞死斑。多數病程在30d 以上，個別病例因體質問題導致病情惡化甚至死亡。

2.3 豬瘟的檢測

獸醫在豬瘟臨床診斷中主要根據測試體溫、臨床發病情況、特點、傳播方式、易感動物、死后剖檢觀察的病理變化可做初步診斷。而確診需要結合實驗室診斷而進行，參見附表。

通常情況下，豬瘟免疫控制階段以血清學檢測為主，監測凈化階段以病原學檢測為主?？贵w檢測用于了解機體免疫功能及豬瘟的免疫保護水平，病原學檢測用于確診豬瘟病毒野毒感染。血清學檢測方法優先選用ELISA 方法或其他經試劑比對和有效驗證可靠的方法。病原學檢測應選用敏感性等于或高于RT-PCR 的方法。

諸多檢測應用方法中，豬瘟單克隆抗體在豬瘟防疫各階段應用的頻率最大，而且取得優于多克隆抗體的監測效果。

附表 豬瘟診斷指標和發病情況匯總表

3 關于豬瘟單克隆抗體

抗體是分子識別的重要載體，被普遍應用到各豬病的診斷實踐中。而單克隆抗體是通過將抗原注入宿主動物體內啟動機體免疫應答而產生的。因而制作單克隆抗體的大多數操作都是在體外將來自這些宿主的脾細胞與培養的惡性骨髓瘤細胞進行融合。將獨特的細胞克隆分離出來，融合步驟中存活下來的細胞稱為雜交瘤。雜交瘤因骨髓瘤特性而可以永生，且容易在培養物中繁殖。

不同于多克隆抗體，單克隆抗體用于豬瘟診斷體現出不可比擬的優越性：第一，在體外生存環境中，雜交瘤存活時間更長，在傳代生長中能持續形成高均一、高特異抗體。第二，提純不純抗原，獲得高特異的抗體，提升識別檢測的準確性。第三，能獲得無限量的均一抗體，尤其適合抗體標記的免疫學分析，區別于多克隆抗體檢測效果更好。

但也有缺點，第一，單克隆抗體制備成本更高些，技術更復雜，篩選難度更大，使用價格更高。第二，單克隆抗體診斷技術存在明顯的局限性，生物活性的親和性和局限性大大限制其應用范圍，尤其不能用于沉淀和凝聚反應的實驗室診斷。

4 豬瘟單克隆抗體診斷技術的推廣

4.1 基于豬瘟單克隆抗體的豬瘟抗原診斷

張富強等以單克隆抗體為包被抗體，以噬體表位為競爭指示劑，以標記HRP 為檢測抗體，由此而建立起的競爭ELISA方法。在后續推廣試驗中，用于70 份的血清樣品監測，證實較國家標準的抗原捕捉ELISA 方法敏感性更高。同時，推廣應用的試劑中很多不含有病毒成分，不具有傳染性，可作為常規檢測方法加以推廣。張長弓等用膠體金標識單克隆抗體研發豬瘟膠體金快速監測技術。在推廣試驗中，該試紙用于弱毒活疫苗和脾淋弱毒苗的檢測，均顯示為陽性。而其他豬源病毒的檢測均顯示陰性，證實該試紙用于豬瘟抗原診斷的高敏性。此外，考慮到該單克隆抗體與野毒有很大區別，為在區分野毒抗體方面存在很大差異[1]。陸芹章等用CSFV 單克隆抗體成立抗原診斷方法。在比較一元和二元單抗的檢測比較中很好地證實二元的協作能力更強，更有利于捕捉病毒，用于鑒別診斷。De las Mulas 等及Narita 等利用針對E2 糖蛋白的單抗建立了檢測福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品中豬瘟病毒抗原的免疫組織化學方法。該方法的優點是能檢測長期保存的樣品，缺點是比較費時，而且福爾馬林固定后的組織不能再進行病毒分離[2]。劉建文等以3 株CSFV 特異性單抗聯合作為捕捉抗體，建立了檢測CSFV 抗原的AC-ELISA，單抗的聯合應用提高了該方法的敏感性，對31 份臨床樣品進行平行檢測，該方法與病毒分離和RT-PCR 方法的符合率分別為86.2%和90.3%。該方法將單抗特異性和ELISA 方法的敏感性有機地結合起來，能短時間內準確、快速、直接檢測大批量樣品中CSFV 抗原，且明顯優于病毒分離和免疫熒光等方法，更適合于各級獸醫研究機構和生產單位應用。由于3 株單抗與BVDV 無交叉反應性，也可達到與BVDV 鑒別診斷的目的。

4.2 基于豬瘟單克隆抗體的豬瘟抗體診斷

劉勁松等用酶標記CSFV 抗體建立的競爭ELISAD 法，試驗用5 份未吃乳仔豬血清和79 份疫苗注射不同生豬的血清監測。結果顯示，注射前血清母源抗體抑制率在50.8%，注射后2 周母源抗體抑制率在60.8%，與HRP-SPA-ELISA 的檢測結果呈正相比關系。由此可見，豬瘟病毒抗體檢測能準確反應疫苗注射前后抗體水平和免疫水平。梁冰冰等用豬瘟重組E2 蛋白作為競爭抗體，建立一種能有效檢測抗體的E2 蛋白競爭抑制ELISA 方法。經試驗比較，該檢測結果與IDEXX 公司的試劑檢測吻合度高達90%以上。同時，測得的抑制率更呈正相關。由此可證實，E2 蛋白競爭抑制ELISA 方法，能更高效定量檢測出免疫后的中和抗體水平，適合用于初期抗體水平的流行情況檢測。國外學者Claqvijo 等嘗試用豬瘟E2 基因表達產物制備單克隆抗體，經該種方法成立的競爭ELISA 方法在臨床試驗比較的2000 多份血清檢測中證實有效的特異性反應和敏感性反應分別達到100%和85%。另外，考慮到該單抗不具備中和性，可用此法推廣到豬瘟病的監測和流行病學調查。