禽大腸桿菌對慶大霉素的耐藥性誘導試驗

王秀英

（遼寧省鐵嶺縣凡河動物衛生監督所 112600）

1 試驗材料

1.1 微生物培養設備

恒溫箱、微生物接種用具、微量移液器、營養瓊脂、伊紅美蘭培養基、乳糖膽鹽培養基、試管、童氏小管、溴甲酚紫試劑等。

1.2 試驗菌種來源

來源于鐵嶺市種雞場近期未用藥自然發病雞的病料分離培養，經生化試驗和血清學檢查確定為致病性大腸桿菌，并在培養基中多次繼代培養。

1.3 藥敏紙片

自制藥敏紙片，每片含硫酸慶大霉素20μg[1]。

2 試驗方法和步驟

2.1 試驗菌種藥敏試驗

采用K-B 法在營養瓊脂培養基上涂布法接種試驗用大腸桿菌，置恒溫箱中37℃培養24h，取出觀察結果，并進行抑菌敏感性讀數。

2.2 確定最小慶大霉素抗菌濃度

根據大腸桿菌的耐藥產生機制，通過不斷適應抗菌藥物環境，進行耐藥誘導試驗。操作方法如下。

（1）取試管8 支。分別乳糖膽鹽肉湯培養。第一支4.9ml，2～9 支4.5ml。

（2）倒置童氏小管，排出氣體，滴0.05%溴甲酚紫指示劑2 滴，高壓滅菌20min，備用。

（3）第1 支液體培養基中用微量移液器加入10%硫酸慶大霉素100μl，反復吹打混合均勻，即為慶大霉素2mg/ml 有效濃度，吸出500μl，加入第2 支培養基中，混合均勻，再吸出500μl 至第3 管，以此10 倍梯度稀釋有效濃度硫酸慶大霉素操作至第7 管，混合均勻，吸出500μl 丟棄不用。第8 去做對照。粘貼標簽，標記各試管中硫酸慶大霉素濃度。

（4）用微量移液器無菌操作向每只試管液體培養基中接種大腸桿菌菌液，搖勻。

（5）置恒溫箱中37℃培養24h，取出觀察結果，觀察培養基色澤變化和童氏小管中氣體產生量，判定細菌是否生長。

2.3 大腸桿菌耐藥性誘導試驗

（1）將耐藥誘導試驗中略微開始生長的試管菌種繼續接種同一濃度乳糖膽鹽肉湯培養基進行繼代培養，無藥乳糖膽鹽肉湯培養基接種作空白對照。

（2）當大腸桿菌逐漸適應抗菌藥物環境生長良好或接近空白對照生長程度時，移接下一個10 倍梯度的慶大霉素乳糖膽鹽肉湯培養基中繼代培養，同時和空白培養對照。記錄繼代培養代數。

（3）大腸桿菌在某一濃度慶大霉素中適應，產生耐藥，生長良好后，即可移接到下一個10 倍梯度的慶大霉素乳糖膽鹽肉湯培養基中，直到無法適應，不再良好生長為止。記錄繼代培養代數和慶大霉素濃度。

（4）保留末代耐藥菌種進行下一步試驗，同時將末代菌種用K-B 法在營養瓊脂培養基上進行藥敏試驗和抑菌敏感性讀數。

2.4 敏感性恢復試驗

（1）末代耐藥大腸桿菌菌種移接至無藥的乳糖膽鹽肉湯培養基中繼代培養。每偶數代培養后進行1 次K-B 法藥敏試驗，分別移接至4lg 和3lg 慶大霉素乳糖膽鹽肉湯中培養，記錄繼代培養代數、生長情況和藥敏試驗數據。

（2）大腸桿菌對慶大霉素性不斷的恢復，至最大數據時停止試驗，記錄恢復培養代數和最后恢復菌種的藥敏試驗數據。

3 結果與分析

（1）慶大霉素最低抗菌濃度試驗結果表明，在4log10 （以下簡寫lg）有效濃度時不能完全抑制大腸桿菌，即開始生長，慶大霉素對大腸桿菌最小抑菌濃度（MIC）為0.02μg/ml。

（2）耐藥誘導試驗中，大腸桿菌在4lg 有效濃度慶大霉素中逐漸適應產生藥性，在下一個10 倍梯度的慶大霉素環境中迅速適應，繼續產生耐藥性，在2log10 有效濃度的慶大霉素環境中無法繼續適應，耐藥性達到最大程度，耐藥性不再增強。大腸桿菌對慶大霉素敏感性明顯下降，由高敏變成低敏。

（3）根據耐藥誘導試驗結果，將2lg 有效濃度的慶大霉素環境中大腸桿菌作為試驗菌種進行敏感性恢復試驗。大腸桿菌在無藥的培養環境中對慶大霉素的敏感性開始緩慢恢復，之后迅速恢復，接近試驗前的敏感程度。

（4）在無藥環境中對大腸桿菌繼代培養進行敏感性恢復結果表明，初期大腸桿菌對慶大霉素的敏感性恢復緩慢，經過一段時間后短時間即迅速恢復對慶大霉素的敏感性，由低敏恢復到高敏程度，幾乎接近初始狀態。

4 小結

（1）慶大霉素對大腸桿菌最小抑菌濃度（MIC）為0.02μg/ml，在防治用藥無效時可檢驗體內慶大霉素含量，其含量應至少相當于10 倍MIC，即0.2μg/ml 才能達到抗菌目的。

（2）大腸桿菌對慶大霉素容易產生耐藥性，一旦對慶大霉素適應，迅速產生耐藥性。在無藥的情況下能很快恢復對慶大霉素的敏感性。因此，在臨床防治中不可長期使用慶大霉素，通常突擊性使用一個療程，以免產生耐藥，出現耐藥后停止應用氨基糖苷類藥物一段時間即可恢復敏感性[2]。長遠來看，慶大霉素仍然是治療大腸桿菌的一種有效藥物。