蜂產品指紋圖譜的研究進展

張敏倩，劉功良，趙曉娟，趙文紅，白衛東，蔡金鑫，何家全

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225；2.安徽盼盼食品有限公司，安徽滁州 239001；3.廣州市寶生園股份有限公司，廣東廣州 510100）

作為純天然的營養保健品，蜂產品具有預防和治療多種疾病的功效。與其他國家相比，我國在養蜂方面屬于世界第一大國，多種蜂產品產量位居世界之首。目前，不規范的環節在蜂產品（如蜂蜜、蜂膠）的生產和流通中仍廣泛存在，其中，人為摻假最為普遍。然而，如今的國家標準復雜繁瑣，以致于難以滿足快速準確的檢測需求。除此之外，蜂產品的質量在現行的制度體系下難以保障。因此，利用指紋圖譜等當代分析方法對提高蜂產品品質具有重要意義。

如今，食品行業尤其是藥物化學中的中藥行業，指紋圖譜技術已經得到了廣泛的應用。而在蜂產品行業中，如不同品種的蜂蜜中會存在微量的生物活性物質和非活性物質，通過指紋圖譜技術檢測這些特征物質能夠有效區分蜂蜜的植物源并用于蜂蜜的品質控制，尤其在蜂蜜的成分分析和真偽鑒別中；除此之外，對于蜂膠的植物源、成分和真偽的鑒別也極具實際應用意義。

1 指紋圖譜的簡介及種類

指紋圖譜技術建立于現代儀器分析、數學統計手段和計算機模擬方法的基礎之上[1]，是一門可通過特定的信息化處理后能對產品進行分析識別的技術，可將蜂產品中特有的品質，如香氣、滋味、元素組成、形狀、色澤等進行品質優劣判別和真偽識別[2]；對于品種鑒定工作，具有快速、方便、準確、不易受環境影響等特點。

指紋圖譜技術根據測定方法的差別可分為色譜指紋圖譜與光譜指紋圖譜兩大類，其中，氣相色譜指紋圖譜和液相色譜指紋圖譜屬于色譜指紋圖譜；紅外（IR）指紋圖譜、紫外（UV）指紋圖譜、核磁共振譜（NMR）指紋圖譜、質譜（MS）指紋圖譜等屬于光譜指紋圖譜。IR主要用于純物質組分鑒定，UV則能夠在一定程度上反映樣品中各化學成分的差異。

2 蜂產品在色譜指紋圖譜中的應用

2.1 氣相色譜指紋圖譜

氣相色譜法（GC）是一種分析速度快、靈敏度高、運用規模大、可分析和分離繁雜混合物的手段。此外，其他近代分析儀器與氣相色譜法的聯用技術也因易操作、高靈敏等特點被廣泛用于蜂產品成分、結構的常規分析，如氣相色譜與質譜聯用（GC-MS）。

夏立婭等人[3]研究棗花蜂蜜中揮發性成分的指紋圖譜，利用固相微萃取技術與氣相色譜法聯用（SPME-HPLC）先分離檢測棗花蜂蜜中的揮發性成分，并根據檢測結果建立指紋圖譜，為科學評價及有效控制棗花蜂蜜質量提供依據。涂世等人[4]通過超聲波輔助萃取法提取49種油菜單花蜜的揮發性物質，并利用氣相-氫火焰化離子檢測（GC-FID）和GC-MS技術分析，隨后進行聚類分析和相似度分析，從而建立油菜單花蜜揮發性成分的指紋圖譜。結果表明，試驗所用的油菜蜜分為5類。未經加工的原料油菜蜜和市售油菜蜜中的揮發性成分差異顯著。苯甲酸-4-羥基-3,5-二甲氧-酰肼可作為油菜蜜植物源標記物。姚偉宣等人[5]建立了Fe3O4/AMWNTs磁性分散固相萃取-氣相色譜測定6種菊酯類農藥殘留的分析方法，該方法可用于2種市售蜂蜜中菊酯類農藥的殘留分析，回收率高于78.4%。該方法能有效檢測蜂蜜中痕量菊酯農藥的殘留量，具有易操作、高靈敏度的優點。王蓓等人[6]采取SPME-HPLC分析了蜂膠超臨界CO2萃取物中不同香氣的揮發性成分，確立了國產蜂膠超臨界CO2萃取物GC-MS指紋圖譜，該圖譜由8個共有峰及其相關信息構成。對GC-MS分析數據進行聚類分析并結合我國地理區劃特征。結果顯示，黑龍江、河北、云南、海南、山東、河南、湖北、湖南和四川的蜂膠超臨界CO2萃取物特征成分組成相近。肖利龍等人[7]建立了QuEChERS-氣相色譜法對蜂花粉中9種有機氯類和6種擬除蟲菊酯類農藥殘留進行定性定量的分析。結果表明，該法能有效分離9種有機氯和6種擬除蟲菊酯農藥，峰形良好，具有簡單、快速、高效的優點。

2.2 液相色譜指紋圖譜

高效液相色譜（HPLC）在色譜指紋圖譜中應用最為廣泛[8]，不僅可應用大部分的有機物，還具有檢測速度快、檢測效率和靈敏度高等特點。近年來，作為一種準確快速、易于自動化的檢測方法，HPLC在食品分析中的應用中得以快速發展。當前，HPLC廣泛應用于蜂產品成分的定量與定性的常規分析，對于蜂產品的品質控制和真偽判別具有極高的應用前景；反相液相色譜在類黃酮成分分析方面均有報道；高效液相色譜-質譜（HPLC-MS） 聯用，可以將色譜圖中未知成分的各峰進行歸類。

在僅采用HPLC方面，王文靜[9]對洋槐蜂蜜黃酮類化合物指紋圖譜進行了研究，由25種供試樣品色譜圖得出，我國的洋槐蜂蜜黃酮類化合物在品種和含量上存在差異；供試樣品中含有蘆丁、棚皮素和山奈酚。陳磊等人[10]采用HPLC檢測新西蘭Manuka蜂蜜中的甲基乙二醛。結果表明，該方法不僅可用于新西蘭Manuka蜂蜜的品質控制，也適用于中國蜂蜜中甲基乙二醛的檢測，具有前處理過程簡單、良好的靈敏度、回收率和重復性的特點。李櫻紅等人[11]采用HPLC，通過《中藥指紋圖譜相似度計算軟件》計算，對蜂膠、楊樹膠、蜂膠中摻楊樹膠或外源性黃酮類化合物等樣品的相似度范圍進行了限定，從而建立區分蜂膠與楊樹膠的指紋圖譜，為蜂膠真偽鑒別和品質控制提供依據。該方法重復性好、準確度高。寧生榮等人[12]建立油菜蜂花粉的HPLC指紋圖譜，為其品質評價提供參考。對油菜蜂花粉樣品進行色譜分析后，建立其指紋圖譜。應用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統進行相似度評價，并運用聚類分析（HCA） 對指紋圖譜進行模式識別。通過一系列結論表明，建立的指紋圖譜可對其品質評價及控制提供依據。

在采用HPLC與其他技術聯用方面，王韋崗[13]確立了固相萃取-高效液相色譜法（SPE-HPLC）測定蜂蜜中克倫特羅殘留量的方法，并對樣品前處理方法和色譜條件進行了優化。當流動相為甲醇－磷酸鹽為時，采用MCX和HLB固相萃取柱，具有高靈敏度、高回收率、少雜質組分干擾等優點。涂劍秋[14]建立了可靠、靈敏的反相高效液相色譜-電化學檢測（HPLC-ECD）方法，可測定蜂蜜中3種有機酸類電化學活性化合物（沒食子酸、綠原酸、咖啡酸）。韓紅祥等人[15]建立不同基源蜂膠的指紋圖譜，為蜂膠藥材的品質控制提供依據。結果表明，建立的HPLC-MS指紋圖譜具有較好的精密度、重現性和穩定性，可作為蜂膠品質評價主要依據之一。

3 蜂產品在光譜指紋圖譜的應用

3.1 近紅外光譜

近紅外光譜源于化合物中含氫基團C-H，O-H，N-H，S-H，P-H等振動光譜的倍頻以及合頻吸收。而不同基團在近紅外光譜的波長范圍（780～2 500 nm）內對應的峰位、峰強和峰形不同，根據這些差異可進行定性和定量分析，從而快速獲得分析數據[16-17]。近紅外光譜技術具有易操作、低檢測成本、高分辨率、高穩定性等優點，也因其分析速度快、數據采集時間短、儀器的環境適應性強而被廣泛地應用于食品、農產品等領域[18-19]。

不同種類或品質的蜂蜜，其對應的光譜特征不盡相同。因此，蜂蜜光譜特征可作為區分純蜂蜜與摻假蜂蜜的指標，也可用于判斷蜂產品品質的優劣。目前，近紅外光譜技術在蜂產品品質評定與真偽鑒別方面已普遍運用。

近紅外光譜技術應用于蜂蜜內部品質檢測研究方面，邱琳等人[20]利用近紅外光譜儀（NIRS） 和近紅外定量分析技術快速測定蜂蜜中主要成分（水分、果糖、葡萄糖和還原糖）含量，建立蜂蜜主要成分的近紅外定量分析模型。該方法方便、快速、準確地測定蜂蜜的主要成分。侯瑞麗等人[21]利用NIRS檢測蜂蜜中的水分含量、蔗糖含量、還原糖含量和淀粉酶值，紅外分析結果與常規化學測定結果關系相關，標準誤差較低。這說明近紅外光譜可應用于蜂蜜中蔗糖分析以及測定蜂蜜品質參數。陳蘭珍等人[22]選取68個蜂蜜樣品，利用傅里葉變換近紅外光譜（FTIR） 結合偏最小二乘法（PLSR），建立了蜂蜜中果糖含量的近紅外光譜模型。李水芳等人[23]創立了一種利用NIRS研究蜂蜜中可溶性固形物含量（SSC）的技術，并分析了蜂蜜中的水分。用PLSR分別建立了SSC和水分的近紅外透反射光譜校正模型。研究表明，近紅外光譜能夠準確測定蜂蜜中SSC和水分。上述研究證明近紅外光譜技術可用于蜂蜜內部品質的檢測。

在蜂產品的產地和植物源判別研究方面，董蕊[24]采用FTIR建立了苔子蜜、椴樹蜜和刺槐蜜的指紋圖譜。利用該技術可有效區分苔子蜜、椴樹蜜和刺槐蜜的品種、產地和品質，可作為市場上評估蜂蜜品質的參考方法之一。李水芳[25]同時應用NIRS聯用化學計量學方法，建立了蘋果蜜產地和油菜蜜產地的判別模型。研究表明，用小波變換（WT） 結合線性偏最小二乘-線性判別分析（PLS-LDA） 建模更適于蜂蜜產地判別，具有快速判別蜂蜜產地的優勢。楊娟[26]采用NIRS并結合化學計量學方法，構建了鑒別3個蜂膠品種的識別模型。馬氏距離判別、典型判別、分析中建模集與檢驗集的總體判別的結果均良好。因此，近紅外光譜技術能夠對楊樹型蜂膠、樺樹型蜂膠和橡樹型蜂膠進行較好分類。上述研究證明近紅外光譜技術可用于蜂產品產地和植物源判別的檢測。

在蜂蜜真假鑒別中的研究方面，李水芳等人[27]同時為進一步檢驗近紅外光譜技術判別蜂蜜摻假的能力，利用近紅外光譜聯用化學計量學方法對摻入不同濃度甜菜糖漿的蜂蜜進行了定性、定量檢測。研究表明，蜂蜜中摻入甜菜糖漿后，NIRS可以快速鑒別蜂蜜的真假性，但對于蜂蜜中摻假量的定量分析無法實現。陳桂云等人[28]采用近紅外光譜研究了摻入不同濃度高果糖漿的9種原蜜，結果驗證了短波近紅外光譜技術可用于蜂蜜摻假鑒別。上述研究證明近紅外光譜技術可用于蜂蜜真假鑒別的檢測。

3.2 中紅外光譜

中紅外光譜具有與近紅外光譜一樣的檢測快、靈敏度高的優點，且均提供了有機分子的振動信息。不同在于其波數范圍為4 000～400 cm-1，所檢測到的是分子振動的基頻吸收，優于近紅外的檢測限，所表達的樣品信息量更加豐富，更能體現出樣本的信息[29]。目前，中紅外光譜分析技術大多用于蜂蜜真偽判別上。同時，在對植物源的判別的研究中、對不同植物源蜂蜜進行鑒定和分類中，中紅外漫反射光譜聯用多變量分析技術具有應用意義。

楊娟[26]同時采用中紅外光譜技術聯用化學計量學方法，創建了鑒別5個蜂蜜品種的識別模型和蜂膠品種真實性的識別模型。典型判別分析法顯示，樣品在建模集和檢驗集的總體判別準確率相對較高，因此，中紅外光譜技術結合典型判別分析不僅可以較好地對荔枝蜜、荊條蜜和油菜蜜進行品種鑒別，對于蜂膠真偽鑒別也具有一定的可行性。

梁奇峰[30]運用中紅外光譜對純蜂蜜和摻假蜂蜜進行鑒別，結果表明，不同品種的純蜂蜜紅外光譜大致一樣，但摻有葡萄糖、蔗糖、黃糖等物質的摻假蜂蜜，其紅外光譜與純蜂蜜在2個波段范圍中有明顯的區別。因此，利用中紅外漫反射光譜聯用多變量分析技術對不同植物源蜂蜜進行鑒定和分類，進行中紅外漫反光譜和一階、二階導數變換后，再分別利用PCA，LDA和聚類分析方法對不同植物源蜂蜜進行分析。結果表明，采用LDA和聚類分析方法可以獲得將近100%判別正確率。吳杰等人采用FTIR聯用二階導數譜和熱擾動下的二維相關紅外光譜技術的三級紅外宏觀指紋圖譜法，對6種不同花粉（杏花花粉、油菜花粉、茶花花粉、西瓜花粉、荷花花粉和虞美人花粉）進行了快速無損的鑒別。結果表明，6種花粉不僅在一維和二階導數譜圖可看出明顯差異，通過二維譜圖還可以準確鑒別不同花粉品種。因此，三級紅外宏觀指紋圖譜法是鑒別不同蜂花粉種類的一種有效和快速檢測方法。

3.3 紫外光譜

紫外-可見吸收光譜是由分子中價電子能級躍遷產生的，利用物質的紫外-可見吸收光譜的形狀、吸收峰的數目及最大吸收波長的位置可以對物質的組成、含量和結構進行分析、測定、推斷。因此，利用紫外光譜可有效地進行蜂產品的品質區分和真偽鑒別。

張婷婷對37個中國蜂膠的醇提物（EEP） 進行紫外光譜（UV）掃描，并對UV掃描數據進行主成分分析（PCA） 和線性判別分析（LDA） 分析。PCA和LDA的結果均表明，該模型可對不同顏色蜂膠進行有效區分。故UV結合多變量分析可將不同品質的蜂膠進行區分。丁青芝等人采用紫外光譜對東北黑蜂蜂膠乙醇提取物（EENBP） 的進行了分析。結果表明，東北黑蜂蜂膠的醇提物與其他地區的蜂膠存在共性，基于獲得的提取物在波長292 nm處有最強吸收，表明東北黑蜂蜂膠有可能具有較強的抗氧化性；蜂膠提取物的紫外光譜特征明顯，有望用于蜂膠真偽鑒別和產地鑒別。

3.4 核磁共振

在化學、生物、醫學等領域中，氫核磁共振（NMR）是一種能夠解析有機小分子和生物大分子結構的研究和分析測試工具。NMR技術因具有樣品預處理簡單、無損傷性，可進行實時和動態的檢測、試驗方法靈活等優點得到廣泛應用。

楊娟[26]同時構建基于核磁共振光譜技術結合化學計量學方法鑒別5個蜂蜜品種的識別模型。通過典型判別分析和組質心區分可知，核磁共振光譜技術可以椴樹蜜、洋槐蜜和油菜蜜進行較好的品種判別。陳雷等人利用氫核磁共振譜圖結合正交偏最小二乘（OPLS）法對油菜蜂蜜和果葡糖漿摻假蜂蜜進行判別分析。結果表明，在OPLS得分圖中能明顯區分油菜蜜和果葡糖漿摻假蜂蜜樣品，可實現油菜蜜中果葡糖漿摻假的快速鑒別。該方法是基于對蜂蜜成分的整體分析，為蜂蜜品質監控提供了一種新思路。Ribeiro等人利用低頻的氫核磁共振（LF-1H-NMR） 檢測摻有不同濃度高果玉米糖漿蜂蜜的縱向弛豫時間T1和橫向弛豫時間T2。結果表明，不同摻假比例的蜂蜜的pH值、顏色、水分含量、水分活度和灰分在T2上均具有差異性，說明LF-1H-NMR可以用于區分純蜂蜜和摻雜有高果糖玉米糖漿的蜂蜜。鄭馨通過主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），以TSP作為內標，采用氫核磁共振檢測對不同花源、產地和生產日期的蜂蜜樣本進行分析。結果表明，氫核磁共振檢測與多變量統計方法相結合能有效分辨不同蜂蜜間的差異，鑒別蜂蜜的真偽。

4 結語

具有保健功能的蜂產品因其天然、健康、養身等功效廣受群眾的歡迎。然而，正因為消費需求大，商家為了提升競爭力，出售低價格的摻假蜂蜜或蜂膠；除此之外，在蜂產品的生產與原料環節也頻發問題，從而導致目前市場上蜂產品的食品檢測合格率低。為了提高蜂產品品質，保證蜂產品市場的安全與秩序，可利用指紋圖譜的多樣性鑒別蜂產品的真偽和質量的優劣，從而為生產商的安全生產、各級檢驗部門的質量抽查，為消費者安全、放心的食用蜂蜜提供更有效的保護技術。此外，在蜂產品的研究開發中，利用指紋圖譜可以有效地反映蜂產品中的各種化學成分及其工藝貯存過程中的變化，從而有效地跟蹤蜂產品研究進展，使研制的蜂產品品質更可靠、穩定。

因此，指紋色譜技術不僅可作為蜂產品檢測的主要憑證，還能為蜂產品研發等問題提供技術保證，從而優化蜂產品市場，使其走向規范化、品質化和國際化。為了實現這個目標，可通過完成基礎工作，如確定有效成分以及收集產地、采收期及釀造加工方法等資料，從而建立全面的蜂產品指紋圖譜庫，更好地為人類的健康服務。