蜂膠有效成分檢測的研究進展

彭立影，劉功良，李南薇，趙文紅，白衛東，蔡金鑫，譚東山

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225；2.安徽盼盼食品有限公司，安徽滁州 239001；3.廣州市譚山蜂業有限公司，廣東廣州 510925）

蜂膠是蜜蜂從植物葉芽或樹干破皮傷處采集的樹脂類與其上顎腺、蠟腺的分泌物混合而成的具有芳香氣味的物質。蜂膠是一種黃酮類物質含量高達10%的獨特而寶貴的純天然保健食品資源和藥物資源，具有豐富而獨特的生物活性物質。蜂膠的化學成分復雜多樣，主要有黃酮類、萜烯類、酚酸類、醇類、香豆素類和脂類等，生物活性廣泛，已成為國內外蜂產品研究與開發的熱點。已有研究表明，其功效成分具有抑菌消炎、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、護肝等作用[1-5]。近幾年，蜂膠市場出現產品品質問題，以次充好、以假當真的案例屢見不鮮。現行標準對蜂膠品質的評價方法采用傳統的定性定量方法，難以全面評價蜂膠的品質和判別蜂膠產品的真偽優劣。因此，有必要對蜂膠有效成分檢測深入研究。對蜂膠主要有效成分檢測方法的最新研究進展進行綜述，并對今后的進一步研究提出展望。

1 蜂膠的有效成分

蜂膠的化學成分取決于蜜蜂采集樹脂的地區和植物，不同地區的蜂膠化學成分有所不同。大多數天然蜂膠[6-8]的基本成分有樹脂樹香復合物40%～53%，多酚類12%～17%，多糖類2%～3%，蜂蠟30%～35%，花粉5%～10%。目前，蜂膠中已分離鑒定出的化學成分有300多種[9]，主要包含黃酮類化合物、酸酯類化合物、酚醇類化合物、醛酮類化合物、氨基酸、脂肪酸與脂肪酸酯、糖類化合物、烴類化合物、維生素和礦物質等[10-11]。

2 多酚類化合物的檢測

多酚類化合物是蜂膠中的主要活性物質，包括黃酮類化合物和酚酸類化合物，以及它們的縮合體。多酚類含量隨蜂膠來源的不同而有很大變化，這些差異可能會影響蜂膠的生物活性及臨床作用。研究蜂膠中多酚類成分，不僅有利于控制蜂膠品質，還能為蜂膠功能活性的研究提供理論依據。

2.1 黃酮類化合物的檢測

黃酮類化合物是蜂膠中酚類化合物的主要有效成分，其生物活性成分有楊梅素、槲皮素、白楊素、山萘酚和高良姜素等，具有抗菌、保護心血管、抗氧化和抗腫瘤等作用。研究蜂膠中黃酮類化合物的分析方法對蜂膠及其制品的質量控制十分重要。目前，蜂膠中黃酮的分析方法主要有分光光度法、液相色譜法、液相色譜－串聯質譜法。

楊亞飛等人[12]利用3種分光光度法對國產蜂膠和巴西綠蜂膠中總黃酮檢測方法進行回收率和含量測定，3種方法測定結果偏差較大，其中GB/T 20574—2006的方法最適合蜂膠中總黃酮的檢測。王爍等人[13]將蜂膠囊液體經過聚酰胺粉吸附，真空泵抽濾處理后，以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色劑、蘆丁為對照品，在分光光度計上，于波長510 nm處測定蜂膠中總黃酮的含量。該方法和國家標準《GB/T 20574—2006蜂膠中總黃酮含量的測定方法分光光度比色法》無顯著性差異，但準確度和精密度高，更適用于蜂膠膠囊等脂溶性樣品中總黃酮的測定。陳剛等人[14]采用蜂膠總黃酮測定中聚酰胺粉吸附層析、乙醇提取后顯色和甲醇直接提取這3種方法處理樣品，利用分光光度計測定樣品處理液。甲醇直接提取可獲得較高的回收率，操作方法也相對方便快捷。高效液相色譜法（HPLC）是測定黃酮類化合物的有效方法。陳文等人[15]采用高效液相色譜法，在以甲醇-0.4%磷酸（55/45，V/V） 為流動相，測定蜂膠中7種黃酮類化合物的含量，發現甲醇溶劑超聲溶解浸出法處理樣品操作簡單快捷，與常規分析方法相比，HPLC法測定簡便快速、回收率高、檢出限低、精密度高、受干擾影響小、準確性好。王小平等人[16]利用HPLC法對蜂膠黃酮類物質中的蘆丁、槲皮素、白楊素、高良姜素進行檢測，建立了蜂膠藥材的指紋圖譜分析方法，用以鑒別蜂膠和樹膠。朱恩圓等人[17]采用RP-HPLC測定不同來源蜂膠所含的黃酮類成分，在色譜分析的基礎上以相對穩定的10個峰作為共有峰，建立了蜂膠指紋圖譜，可對蜂膠及其保健品的真偽進行鑒別。

液相色譜-串聯質譜法是以色譜作為分離手段，質譜作為檢測手段。王偉楠等人[18]采用高分辨液質聯用技術對蜂膠總黃酮滴丸進行系統的成分分析，從中指認了5個含量最高的黃酮類化合物，包括山奈酚、喬松素、3-O-乙酰基短松素、白楊素和高良姜素，該方法可在未知提取物中快速分析和推斷主要的化學成分。趙曉亞等人[19]利用線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜，建立了蜂膠中楊梅酮、喬松素、芹菜素、苛因、山奈素、高良姜素、槲皮素、蘆丁、桑黃素等9種黃酮類物質的快速篩選和確證方法，該方法具有準確快速的特點，可用于日常蜂膠中楊梅酮等9種黃酮類物質的定性和定量檢測。劉波靜[20]用GC/MS分析方法分離鑒定出蜂膠中的黃酮類化合物有白楊素、楊牙黃素、良姜素、高良姜素、球松素、喬松素、柚本楊素、5,7-二羥基-3′、4′-二甲基黃酮、5-羥基-4′和7-二甲氧基雙氫黃酮。

高效毛細管電泳（CE）是一種離子域和電離子在電場驅動下，在毛細管中按淌度和分配系數不同而進行高效快速分離的新技術，具有高效快速、分辨率高、成本低，最重要的是具有使用壽命長、易洗脫等優點。彭友元[21]采用毛細管電泳電化學檢測法(CE-ED)，在最優條件下同時測定蜂膠中的黃酮和酚酸的含量。通過重現性、線性范圍及檢測限；回歸方程、線性范圍及檢測下限；樣品測定及回收率等比較，該方法高效靈敏，檢測限為1.0×10-8～1.0×10-7g/mL，檢測限與有關研究人員使用的HPLC方法[22-23]相比降低接近1個數量級，為蜂膠中的黃酮和酚酸的測定提供了一種更為有效簡便的方法。

2.2 酚酸化合物的檢測

羅照明等人[24]用高效液相色譜方法分析9種河南蜂膠醇提物中的多酚類化合物，并定量分析其中25種成分，發現蜂膠中的多酚類化合物主要有咖啡酸苯乙酯、亞桂皮乙酸、p-香豆酸、苯甲酸、異阿魏酸、咖啡酸、3,4-二甲氧基肉桂酸。符軍放[25]采用高效液相色譜法測定中國蜂膠中酚類化合物咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、山奈酚、芹菜素、白楊素、高良姜素、喬松素、松鼠素的含量，建立了中國蜂膠的高效液相色譜指紋圖譜；同時采用電噴霧質譜法分析了中國蜂膠中的化學成分，初步確認出50個酚類化合物。羅照明[26]建立了中國蜂膠醇提物中多酚類化合物的HPLC分離方法，能同時對蜂膠中50多種多酚類物質進行分離；通過HPLC-MS及標準品對照等方法，從我國蜂膠中鑒定出55種成分，包括30種黃酮類物質、20種酚酸及其酯類物質和5種酚酸甘油酯類物質；利用高效液相色譜法對105個蜂膠中多酚類物質進行定量分析，根據蜂膠的成分特征進行分類，建立了每一類蜂膠的HPLC指紋圖譜及總的蜂膠樣品指紋圖譜。

蜂膠中含有游離酸如水楊酸、苯甲酸、咖啡酸和阿魏酸等，能抑制病原微生物及保護肝臟，其含量的變化也會影響蜂膠質量。賀崢嶸等人[27]采用紫外分光光度計、傅立葉變換紅外光譜儀和核磁共振譜儀等技術分析貴州蜂膠中的有機酸成分。周立東等人[28]采用返滴定法測定蜂膠中的游離酸含量，以弱堿溶解再酸化萃取樣品，該方法可有效減少系統誤差，可對蜂膠的質量進行鑒別。孟霞等人[29]采用HPLC法同時分離測定蜂膠中的苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸、肉桂酸、綠原酸，為測定蜂膠液中有機酸類物質提供了方法依據。

3 揮發性成分的檢測

蜂膠中的揮發性成分主要為萜烯類及其含氧衍生物，具有豐富的生物活性[30-31]。蜂膠的揮發性成分可作為一個重要的品質指標，具有指紋特征[32]。目前，蜂膠中揮發性成分的分析方法主要有氣相色譜-質譜分析法（GC-MS） 和固相微萃取（SPME） 技術。

黃帥等人[33]利用GC-MS分析法比較巴西綠蜂膠原膠、乙醇提取液及蜂膠渣中的揮發性成分在化學組成及含量上的差異，分析鑒定出蜂膠原膠揮發性成分中主要活性物質14種，主要是芳香酸及烯萜類化合物；蜂膠乙醇提取液及蜂膠渣揮發性成分中主要活性物質分別為14種和11種，主要為烯萜類化合物和有機酸酯類，蜂膠乙醇提取物中主要揮發性物質還含有烷烴類化合物。田文禮等人[34]通過頂空-固相微萃取法 （HS-SPME） 和氣相色譜-質譜（GC-MS）比較分析中國和馬來西亞蜂膠的揮發性成分，分別檢測到蜂膠中的揮發性化合物為60種和29種，中國醇提蜂膠揮發性成分含量高出馬來西亞醇提蜂膠約10倍，且二者揮發性成分共有物質的含量不同，該結果為進一步對不同來源蜂膠的標準化提供一定的理論依據。李季剛等人[35]采用GC-MS法結合內標法測定蜂膠揮發性香味成分，以同時蒸餾萃取法（SDE）提取揮發性成分，鑒定出70種成分，包括萜烯類、醇、酸及酯等化合物。程煥等人[36]采用GC-MS法檢測蜂膠和楊樹樹膠揮發性成分，以固相微萃取法及動態頂空法對揮發性成分進行提取，鑒定出蜂膠和楊樹膠各自特有的成分，從而為蜂膠的真偽鑒別及其標準制定提供理論依據。

蜂膠揮發油是蜂膠中具有芳香氣味的揮發性物質，其含量約為蜂膠的10%，具有抗氧化和抗菌的作用。楊文超等人[37]采用GC-MS技術對石油醚、正己烷、乙醚、四氯化碳等4種溶劑提取的蜂膠揮發油（分別為 PEP，HEP，TEP，DEP） 的成分進行鑒定分析。其中PEP鑒定出60種化合物，HEP 49種化合物，TEP 46種化合物，DEP 47種化合物，4種精油共有的物質有22種。楊書珍等人[38]采用氣相色譜-質譜聯用法分析湖北蜂膠揮發油中的化學成分，以不同溶劑對蜂膠中揮發油成分進行提取，分析得到蜂膠揮發油中共有64種揮發性化合物，蜂膠揮發油中的主要成分為萜類物質和有機酸，且石油醚是最佳提取蜂膠揮發油的溶劑。Eleni Melliou等人[39]用水蒸氣蒸餾法提取蜂膠揮發油，GC/MS分析，識別出希臘5個不同地區的蜂膠揮發油成分94種，且5種蜂膠組成存在差異。趙強[40]比較了5種提取方式方法對蜂膠揮發油提取率的影響，分析得出5種提取方法的提取率由高到低依次為微波輔助法＞超聲輔助法＞常溫攪拌法＞超臨界CO2萃取法＞水蒸氣蒸餾法。微波輔助提取和超聲輔助提取蜂膠揮發油需要的時間最短，且溫度較低；超臨界萃取法與水蒸氣蒸餾法提取率低，效率低，操作過程復雜，但是提取物以外觀、性狀品評，香味與蜂膠原料氣味相符，顏色和流動性較好，較符合油的特征[41]。

氣味活性成分是指具有氣味活性的揮發性成分，通過鑒別氣味活性成分可更全面地了解各種化合物對食品的貢獻程度[42]。延莎等人[43]采用氣相-質譜-嗅聞儀聯用對3種蜂膠樣品和楊樹膠的氣味活性成分分離鑒定，鑒別出48種氣味活性物質，因此可從氣味特征上區分高品質蜂膠、劣質膠和假膠。董捷等人[44]利用電子鼻對不同區域的蜂膠氣味活性物質進行了分析，找到對氣味活性物質響應顯著的傳感器，該方法為蜂膠品質的鑒定及鑒別摻假蜂膠提供了基礎研究數據。

4 微量元素的檢測

微量元素對人體的正常生理代謝具有至關重要的作用。蜂膠中含有人體必需的各種微量元素，可增強機體免疫機能，有效抑制人體生理的異常。因此，分析蜂膠中的微量元素有利于開發利用我國的蜂膠資源。龐海巖等人[45]采用全譜直讀感耦等離子體發射光譜儀測定了蜂膠及蜂膠制品中的12種元素。楊理等人[46]用微波消解法和電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-AES）對同一地域不同時期蜂膠中的9種微量元素進行檢測，該方法可高效準確地分析多種元素。蘇莉等人[47]用濃硝酸-雙氧水消解對蜂膠進行前處理，采用原子吸收光譜法測定蜂膠中Fe，Cr和Zn等11種金屬元素含量，其含量均與人體所需微量元素相近，且重金屬元素含量均符合國家標準。龔上佶[48]采用電感耦合等離子體發射儀測定不同地區的蜂膠中的15種微量元素的含量，利用主成分分析、聚類分析和判別分析等數學方法處理數據，得出蜂膠元素含量與顏色有密切關系；并采用紅外光譜法得到蜂膠和樹膠樣品的紅外光譜圖，找出蜂膠和樹膠的特征差異。李櫻紅等人[49]采用ICP-MS電感耦合等離子體質譜儀，輔以原子熒光和原子吸收分析方法，對不同產地的蜂膠樣本中元素分布特征及相關性進行測定和分析，從元素組學的角度為蜂膠建立無機元素的特征圖譜提供理論支持，為深入研究蜂膠的元素譜與保健作用的關系提供依據，為蜂膠產品資源開發及品質評價奠定科學基礎。王湘君等人[50]利用ICP-AES法和原子熒光法對五指山蜂產品中蜂蜜蜂膠進行了微量元素的檢測，并與其他地區相關方面的數據進行比對，分析指出五指山蜂蜜產品微量元素優勢明顯，蜂膠微量元素含量方面優勢不顯著，但其中對人體有害元素含量極少。

5 結語

蜂膠成分復雜且生物學活性廣泛，其功效作用的發揮與其品質有著緊密的聯系。控制蜂膠的品質，有利于穩定發揮保健作用。近年來，隨著分析儀器升級、檢測方法改進，蜂膠及相關產品質量控制有了進一步的提升。但蜂膠化學成分復雜，至今尚無法分析得知所有的化學成分，給蜂膠的真偽鑒別帶來很大的難度。可見，蜂膠及相關產品的化學成分標準化仍是蜂膠質量控制的難點。因此，有必要對蜂膠有效成分進一步深入研究，建立一種快速檢測蜂膠品質的方法，進一步健全蜂膠品質檢測體系，以期為今后蜂膠的進一步研究和開發利用提供參考。