ELISA 在基層獸醫實驗室遇到的問題及解決方法

張麗燕

（吉林省梅河口市動物疫病預防控制中心 135000）

酶聯免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）最早出現于1971 年的Engvall E 等進行的 IgG 定量測定中，隨后ELISA 以其操作簡便、樣品容量大、儀器化程度高、檢測成本低、靈敏度高等優點迅速發展成為一種新型免疫酶標記技術，在疫病診斷、食品安全、獸藥殘留等領域均顯示出了良好的應用前景[1.2]。當前幾乎所有的動物疫病都已經研制或正在試圖研制ELISA 試劑盒，ELISA 在基層獸醫實驗室中得到廣泛和普遍應用。盡管ELISA 方法操作簡單，但ELISA 在實際操作過程中涉及的環節較多，在獸醫臨床實際應用過程中如果對ELISA 方法的試驗原理不夠理解或者對ELISA 方法的操作不太熟練，且受到試驗條件、人為操作、環境因素等影響，極易出現假陰性、假陽性等問題，直接影響檢測結果的可靠性與準確性[3]。本文就基層獸醫實驗室在應用ELISA 方法進行檢測中遇到的各種問題和解決方法進行簡要闡述和分析，對全面理解和科學掌握ELISA 方法、保障試驗結果準確無誤、提高試驗人員操作水平、提升基層獸醫實驗室檢測檢驗能力均具有重要的參考價值和指導意義。

1 ELISA 方法的基本原理

ELISA 方法的基本原理是基于酶分子與抗原或抗體分子的共價結合（即酶標記抗原或抗體分子），該共價結合即沒有改變和降低抗原或抗體的免疫學特性，也沒有改變和降低酶的生物學活性[4]。在進行檢測時，首先利用抗原或抗體結合于固相載體表面，受檢樣品中抗體或抗原與固相載體表面的抗原或抗體發生特異性免疫學反應，再加入酶標記的抗原或抗體分子，最后通過加入與酶特異性反應的底物液后顯色，根據顯色后顏色深淺可判定酶量，而酶量與受檢樣品中抗體或抗原的量具有一定相關性，進而實現定性或定量分析。

2 常見問題分析

2.1 樣品采集或處理方法不合適

血清樣品采集過程中出現溶血，此時樣品中可能含有過氧化物酶活性物質，此物質可以與酶標記的抗原抗體發生非特異性結合，改變底物顯色顏色的深淺，造成假陽性或假陰性結果。血清樣品處理過程中污染細菌，而部分菌體中含有內源性過氧化物酶，造成假陽性或假陰性結果。血清樣品處理過程中如果經過凍融，抗體蛋白分布不均勻，吸取的樣品未含有或少量含有抗體蛋白，造成假陽性或假陰性結果。

2.2 試劑盒質量下降

由于試劑盒生產廠家較多，市場上試劑盒的質量參差不齊，且同一生產廠家的不同批次試劑盒之間也存在較大差異，基層獸醫實驗室如果選擇不合理，使用后造成檢測結果不確定，檢測結果的可重復性差。試劑盒在運往基層獸醫實驗室過程中未全程使用冷鏈運輸或冷鏈運輸達不到試劑盒要求，造成試劑盒質量下降。基層獸醫實驗室在試劑盒使用過程中，試劑盒從冰箱拿出來后立即使用，由于試劑盒內冷藏試劑未恢復至室溫，溫度達不到需求，造成試劑盒使用效果下降。在試劑盒使用后未及時放回冰箱，造成試劑盒內冷藏試劑的質量下降，影響試劑盒下次使用。

2.3 加樣器使用不正確

加樣器在吸取液體時速度過快，使槍頭內具有氣泡，導致加樣量不足，影響檢測結果。加樣器在打出液體時速度過，使槍頭內液體外濺，導致酶標孔內加樣量減少，影響檢測結果。向酶標孔中加入液體時槍頭刮擦酶標孔內壁或槍頭插入太深而接觸酶標孔底部，影響酶標孔的吸附功能，增加檢測結果的假陽性率或假陰性率。加樣器在吸取不同液體時未及時更換槍頭，造成交叉污染，影響檢測結果。

2.4 孵育方法不當

孵育時溫度達不到要求，溫度過高或過低直接影響抗原抗體發生免疫學反應的效果。孵育時酶標板沒有利用封板膜密封，致使在孵育過程中酶標孔內液體逐步蒸發，影響檢測結果，且干燥后的抗原抗體附著于酶標孔內壁，很難清洗掉，致使底物顯色后顏色過深。大批量樣品檢測時一般將多塊酶標板疊放孵育，疊放過多造成中間的酶標板孵育溫度不夠，而多塊酶標板疊放可使ELISA 反應出現邊緣效應，造成假陽性或假陰性的檢測結果。

2.5 洗板方法不當

洗板時加入洗滌液過多，孔與孔之間的液體溢出，造成相互交叉污染。洗板時加入洗滌液過少，洗滌不徹底，造成假陽性或假陰性結果。洗板機的洗板針發生堵塞或吸液不暢，抽吸不完全造成洗板不徹底。大批量樣品檢測時酶標板過多，出現排隊洗板且等待時間較長，造成洗板不徹底。

2.6 顯色方法不當

當有A、B 兩種液體為底物顯色夜時，顯色液配制時間過早造成顯色效果下降。加入顯色劑時有液體濺出孔外造成跳孔，發生污染。大批量樣品檢測時由于酶標板過多，部分酶標板可能出現顯色時間過長，影響檢測結果。

3 解決方法探討

3.1 合理采集和處理樣品

血清樣品采集過程中應避免出現溶血，對于已經出現溶血的樣品應舍棄，重新采集。血清樣品處理過程中應避免污染細菌和反復凍融，已經污染細菌的血清樣品可通過離心方法去除細菌，對于菌體已經破裂的樣品應舍棄，不予檢測。凍融后的血清樣品應緩慢混合均勻，避免強烈振蕩。

3.2 合理選擇和使用試劑盒

在試劑盒采購時，應選擇具有批準文號的正規生產廠家生產的試劑盒，避免試劑盒濫用。在試劑盒運輸和保存過程中應保證全程冷鏈，避免試劑盒質量下降。在試劑盒使用前應將試劑恢復至室溫后使用，避免試劑溫度對檢測結果造成影響。在試劑盒使用后，應將試劑盒及時放回冰箱，避免試劑盒質量下降。

3.3 正確使用加樣器

加樣器在吸取和打出液體時應避免速度過快，做到穩吸取和穩打出。加樣器在向酶標孔中加入液體時避免槍頭觸及酶標孔內壁或底部，加樣器在吸取不同液體時應及時更換槍頭。

3.4 掌握正確孵育方法

開始孵育前應提前開啟溫箱，并利用溫度計準確測定溫箱內溫度，避免溫度過高或過低。孵育前應將酶標板利用封板膜進行密封。大批量樣品檢測時盡量避免將多塊酶標板疊放孵育，如實驗條件實在有限，必須疊放時應超過3 塊。

3.5 掌握正確洗板方法

洗板前應調節洗滌液至合適體積，避免洗滌液過多或過少。洗板前應徹底檢查洗板機，保證洗板機的每個針孔均通暢無阻。大批量樣品檢測時應控制檢測樣品數量，每次試驗最好酶標板控制在20 塊板以內，不要太多。

3.6 掌握正確顯色方法

顯色夜應現配現用，嚴禁使用長時間配制后的顯色夜，每次使用后剩余的顯色液應及時舍棄。加入顯色劑時應緩慢加入，避免液體濺出孔外造成污染。顯色時間對顯色效果至關重要，大批量樣品檢測時應盡量爭取同一時間顯色，顯色時間越統一，檢測結果的誤差越小。

4 結語

總之，基層獸醫實驗室在應用ELISA 方法進行檢測時，應加強對ELISA 方法基本原理的理解和掌握，合理采集和處理樣品，合理選擇和使用試劑盒，掌握正確的加樣方法、孵育方法、洗板方法和顯色方法，降低各種影響因素對檢測結果的影響，注重試驗操作細節，認真學習和不斷總結經驗，提升檢測水平，保證檢測結果準確無誤，不斷為動物疫病的防控保駕護航。