我國東北地區格子狀角膜營養不良家系的TGFBI基因突變研究

胡 瑩，劉 馳

0引言

格子狀角膜營養不良(lattice corneal dysprothy，LCD)是一種常染色體顯性遺傳病，是角膜基質層營養不良，以雙側角膜基質層折光格子線條的淀粉樣沉積物為特征[1]，可以發生在任何年齡。其分為四種類型LCDⅠ、LCDⅡ、LCDⅢ和LCDⅢA型，還有一種兼具LCDⅠ的某些特征和LCDⅢ或LCDⅢA的一些特征，由于不能歸屬于任何一型，因此在2002年法國學者Schmitt-Bernard等建議將其定義為中間型LCD即LCDi(intermedium)型[2-3]。其中最常見的是LCDⅠ。目前報道的LCDⅠ的基因突變，除伴有全身淀粉樣變性的LCDⅡ型(又稱Meretoja綜合征)為9號染色體Gelsolin基因突變外，其余均為位于染色體5q31上的TGFBI基因(transforming growth factor β-induced gene)，TGFBI基因也是第一個被確定的角膜營養不良的致病基因[4]。它包含17個外顯子，其中第4、11、12、13、14外顯子被認為是突變熱點[5]。我們對我國東北地區一家系中家族性LCDⅠ患者的TGFBI基因進行突變檢測，了解我國東北地區家族性LCD的臨床表型和突變類型。

1對象和方法

1.1對象于2017-02選取來自中國東北地區同一家系的2名正常者(Ⅱ∶3和Ⅲ∶2)和3例患者(Ⅲ∶1、Ⅲ∶4、Ⅲ∶5，圖1)為研究對象。對該家族所有參與者進行裂隙燈檢查，以確定是否受到角膜營養不良影響或不受影響，并確定疾病表型。獲得所有參與對象的詳細臨床病史，例如發病年齡、初始體征和癥狀、疾病進展、其他眼部治療過程等。從沈陽市第四人民醫院體檢中心招募了50名健康人作為對照組，無相關視力障礙的病史。該家系成員為漢族，無近親聯姻史，長期居住遼寧省。本研究已經取得沈陽市第四人民醫院倫理委員會批準，在研究之前獲得所有受試者書面知情同意書。本研究中的所有程序都遵循赫爾辛基宣言的原則。

1.2方法

1.2.1DNA提取取外周靜脈血2mL，置于真空采血管中，4℃冰箱保存，1wk內應用血液基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取。

1.2.2聚合酶鏈反應采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)分別對TGFBI基因的外顯子進行擴增。特異性引物均由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。PCR體系：ddH2O 37.4μL，10×Buffer 5μL，dNTP 2μL，引物F 2μL，引物R 2μL，DNA模板2μL，LA Taq酶0.4μL。PCR循環條件：95℃預變性5min，94℃變性30s，退火30s(不同引物退火溫度不同，表1)，72℃延伸45s共30個循環，最后72℃總延伸7min。PCR產物檢測：用2%瓊脂糖電泳，取PCR擴增產物3μL與1μL甘油溴酚藍加樣液混合均勻后加入凝膠上樣孔中，進行95V恒壓電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE。暗箱式紫外投射儀中成像檢測，保存圖片。

1.2.3PCR產物直接測序將PCR產物和引物送華大基因生物技術有限公司進行純化，并進行測序。將其結果與GenBank中的原始序列進行Blast比對，并對所得到的序列圖譜進行分析，以確定是否存在基因突變。

2結果

2.1臨床檢測結果通過眼科檢查和追問家族史確定了該家系中有6例患者，其中3例患者(Ⅲ∶1、Ⅲ∶4、Ⅲ∶5)參與本研究。受影響的LCDⅠ受試者表現出類似的臨床特征，除了患者Ⅲ∶5呈現輕度癥狀。該家族中的先證者(Ⅲ∶1)和患者Ⅲ∶4曾就診于我院，最初被診斷為LCDⅠ。先證者自35歲以來經歷了雙側反復發作性眼紅、疼痛、畏光、異物感、流淚等角膜刺激癥狀，并且在過去的10a中雙側視力進行性惡化。裂隙燈檢查顯示中央角膜表面基質伴有上皮侵蝕中的各種不同線性沉積物(圖2)。在具有LCDⅠ的該家庭中鑒定出TGFBI基因中的R124C突變。也發現患者在大約21～25歲時開始表現出輕微的異物感，并表現出明顯的視力下降。

2.2分子遺傳學檢測結果該家系中患者的測序結果均發現TGFBI基因第4外顯子370位點堿基C>T的改變，蛋白質由編碼精氨酸的CGC突變為編碼半胱氨酸的TGC，即發生了R124C突變，為雜合子(圖3)。家系中的正常成員(Ⅱ∶3和Ⅲ∶2)和正常對照組均未發生TGFBI基因突變。

2.3生物信息學分析結果應用Polyphen-2軟件分析突變蛋白的各物種間的保守性結果顯示(圖4)，該突變氨基酸在各物種間高度保守，并且該突變具有致病性。

3討論

LCDⅠ是一種常染色體顯性遺傳性角膜淀粉樣變性病，伴有嚴重的視覺缺陷，TGFBI基因突變是LCDⅠ發病的主要原因。本研究中，在一個中國東北地區LCDⅠ家系中檢測到TGFBI基因的雜合突變c.370C>T(p.R124C)。近年來研究發現，TGFBI基因的突變至少與5種類型遺傳性角膜營養不良的發病相關。在所報道的突變中，TGFBI基因中的R124似乎是全世界各種族群不同類型角膜營養不良中檢測到的“熱點”點突變[6]。同時，研究也發現TGFBI基因的第4外顯子中的R124在許多不同物種中高度保守(圖4)，表明該殘基是蛋白質的重要功能和結構位點。因此，研究該疾病的基因突變并鑒定發病家族的臨床特征和表型-基因型相關性非常重要。

表1TGFBI基因第4、11、12、13、14外顯子的引物序列和PCR擴增條件

外顯子引物序列退火溫度(℃)片段長度(bp)4FCTGTCAGAGAAGGGAGGGTGG592964RCGGGGAAGTAAGGCAGATC11FTGACCCTGCTAATGCTCTG6027711RCCAGCATGACCAACTGGG12FAAAATACCTCTCAGCGGGTG5827012RGCCCTGAGGGATCACTACTTAG13FCCAGGCTAATTACCATTCTG6025013RTGAGATATGTCCTGGAGCC14FGGCGACAAGATTGAACTCC5923014RTCTTCTCTCCACCAACGCC

圖1格子狀角膜營養不良家系圖譜。

伴有相同突變甚至在同一家族中的角膜營養不良患者的表型變異潛在機制需要進一步研究。因此，雖然已經有LCDⅠ家系中R124C突變的表型變異的研究[7]，本研究中還要對該家族中被診斷為LCDⅠ的3例患者進行基因突變分析，以評估遺傳異質性。在本研究中，具有R124C突變的患者表現出與LCDⅠ類似的臨床特征。雖然患者Ⅲ∶5表現出輕微的癥狀，但它們都具有細微線性混濁，主要位于角膜基質并伴有上皮侵蝕。分子遺傳學分析對確定角膜營養不良的分類很重要，揭示可靠的臨床診斷標準，提高臨床診斷的準確性。盡管患者Ⅲ∶5沒有表現出LCDⅠ的典型臨床特征，但是與其他2例患者攜帶相同的R124C突變，因此被診斷為LCDⅠ。這表明遺傳分析可能用于產前和產后DNA診斷。在裂隙燈檢查受影響的家庭成員時，發現他們的角膜上皮均被侵蝕，表現為畏光和流淚。有學者觀察發現角膜營養不良的患者Bowman膜異常形態，發現神經纖維密度明顯減少甚至消失；損傷的Bowman膜很可能不能為角膜神經生長提供營養，從而導致角膜沉積。如果這種角膜營養不良是由于缺乏營養，這種疾病可能用神經營養因子治療。TGFBI蛋白涉及各種細胞類型的細胞黏附和遷移，包括上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞[8]。因此，患有TGFBI R124C突變的患者可能表現出角膜上皮細胞與整個上皮層之間連接的松弛，導致該家族中角膜基質營養不良。此外，神經纖維不能長入Bowman層導致角膜上皮細胞缺乏神經營養，導致角膜上皮脫落(圖2)。

圖2先證者和Ⅲ∶5患者的角膜裂隙燈顯微鏡照片A：先證者的角膜上皮混濁，基質層中典型的格子狀線條；B：先證者的角膜上皮熒光素染色顯示上皮缺損；C：Ⅲ∶5 患者(17歲)，角膜上片小片缺損，基質層中單個的格子狀線條。

圖3分子遺傳學檢測結果A：家系中患者TGFBI基因4號外顯子第370個堿基呈雜合性點突變C→T，導致編碼該密碼子的精氨酸變成半胱氨酸；B：正常的4號外顯子序列。

圖4Polyphen-2軟件分析結果，該突變氨基酸在各物種間高度保守，并且該突變具有致病性。

總之，在具有LCDⅠ的中國東北地區家庭中鑒定了TGFBI基因的突變。目前的研究結果表明了LCDⅠ的臨床特征，并在該家族中揭示了明確的基因型相關表型，這可能有助于進一步理解TGFBI基因突變在LCDⅠ發展中的作用。然而，患者角膜層的組成仍然未知，因此其具體的潛在機制需要進一步研究，且需要未來的功能性研究以確認TGFBI基因的作用和疾病發生的潛在機制。