角膜緣干細胞研究新進展

李典睿，周善璧

0引言

正常角膜無血管、透明、神經豐富，為人眼屈光介質的最外層，屈光能力最強。位于角膜表層的角膜上皮細胞層，因處于不斷脫落和更新的動態平衡中，而維持角膜的透明性、屈光性和眼表的完整性，保障視功能完好。角膜上皮細胞的不斷更新，是由Vogt柵欄結構區角膜緣基底層內的角膜緣干細胞(limbal stem cells, LSCs)不斷增殖、分化、移行而來。LSCs為眼表穩定提供了保障。感染、外傷、物理刺激等，引起LSCs受損、缺失，導致角膜緣干細胞缺乏(limbal stem cell deficiency, LSCD)。致使角膜結膜化、血管化、瘢痕化等，角膜透明度下降，甚至功能缺失。單眼LSCD可通過從健眼取材，對患眼行角膜緣干細胞移植治療。雙眼LSCD則需移植異體角膜緣干細胞進行治療。角膜緣干細胞體外培養技術，為這些患者帶來了新的希望。

1角膜緣干細胞定位

角膜與不透明鞏膜相聯系的環形區域為角膜緣，Schermer在1986年首次證明了LSCs為位于角膜緣Vogt柵欄結構區的角膜緣基底細胞。柵欄樣的上皮結構為角膜緣隱窩，但該區域的干細胞較少。2005年，Dua等[1]通過對角膜切片的觀察研究，發現了Vogt柵欄結構區中存在的一種極其少量的實性細胞條索，其內所有細胞ABCG2呈陽性。Dua等稱該結構為角膜緣上皮小囊 (limbal epithelial crypts，LECs)，同時認為，LECs很可能是存儲LSCs的“龕”。之后的研究又發現，角膜緣中干細胞優先出現在上緣和下緣。還發現OCT可以較好對Vogt柵欄進行定位，但OCT耗時、且費用較貴。為了培養時取材準確、快速，Sigal等[2]通過對圓偏振光(circularly polarized light，CPL)進行了研究。他們將樣本角膜緣以時鐘12∶00方向定位后，先用OCT進行成像，定位Vogt欄桿區。再分別用線偏振光、圓偏振光照射成像。之后將三者的結果進行比較，發現CPL的定位結果與OCT的結果相符。并用免疫標記法標記膠原蛋白Ⅶ，識別角膜上皮基底細胞的細胞膜，以進一步驗證CPL的定位結果。通過他們的研究顯示，CPL可以在以后的研究中或角膜緣干細胞移植時，快速、準確地定位Vogt欄桿區，從而方便LSC的取材。

2角膜緣干細胞標志物

若要分離出單個角膜緣干細胞，角膜緣干細胞的特異性標志物必不可少。而在過去的幾十年里，研究者們為此付出了許多努力，并提出了許多可能成為特異性標志物的生物因子，但仍沒能找出角膜緣干細胞的特異性標志物。國內外學者通過細胞生物學、分子生物學等方法從干細胞的蛋白、胞漿、染色體、核糖體等，甚至細胞與細胞間、LSC周圍的微環境中尋找特異性的標志物，并提出了許多可能成為標志物的“候選人”。

2.1目前角膜緣干細胞的推定標志物分類目前角膜緣干細胞的推定標志物分類[3]:(1)細胞結構蛋白：細胞角蛋白K5/K14、細胞角蛋白15、細胞角蛋白19、波形蛋白(Vimentin)；(2)細胞黏附因子：整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α6、整合素α8、整合素α9、整合素αv、整合素β1、整合素β4、整合素β5、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、P-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、Frizzled7；(3)細胞酶：α-烯醇化酶、細胞色素氧化酶、Na+/K+-ATP酶；(4)生長因子及其受體：上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGF-R)、神經生長因子(nerve growth factor,NGF)等；(5)細胞周期調節因子：ΔNp63α；(6)ATP結合盒式轉運蛋白：ATP結合盒式轉運蛋白2(ATP-binding cassette subfamily G member 2, ABCG2)、ATP結合盒式轉運蛋白5(ATP-binding cassette subfamily G member 2, ABCG5)；(7)分化相關標志物：連接蛋白43(connexin 43, Cx43)、細胞角蛋白K3/12、外皮蛋白(Involucrin)。

2.2可能的新標志物(1)基于RNA或mircoRNA的生物標志物：在過去的生物醫學研究中，學者們已經廣泛地應用到了二代測序技術(next generation sequencing，NGS)，使得我們能夠獲得更多的有關RNA和mircoRNA的信息。近年，其他方面的研究，已報道了許多RNA水平的新的生物標志物。Howlett等[4]通過對招募的24位符合條件的志愿者進行研究，發現冠狀動脈鈣化的評分>100的人與評分為0的人相比，miRNA8059顯著下調。所以他們認為，miRNA8059可作為這一疾病外周血液中的生物標志物。Shen等[5]運用NGS技術，鑒定出了主動脈夾層患者與非此病患者的主動脈組織樣本中差異表達的miRNA,再對這些miRNA進行了進一步的研究。最后研究結果表明，has-miR-320d和has-miR-582可作為主動脈夾層的生物標志物。由此，我們可以看出，基于RNA或mircoRNA的新的生物標志物的研究，為LSCs的特異性標志物研究，提供了新的方向。(2)Wnt信號通路中的傳導介質：Wnt信號通路廣泛存在于多種生物體內，并在調節干細胞的自我更新中發揮著重要作用。其家族成員存在于多種組織中，進化上具有高度保守性。從低等動物到高等動物中，具有高度的同源性。Wnt信號通路分為：經典Wnt通路(β-catenin依耐性通路)、非經典Wnt通路(β-catenin非依耐性通路)。對經典Wnt通路的研究更多，這一信號通路中所產生的蛋白降解復合物，其可磷酸化β-catenin，使之降解。若蛋白降解復合物不產生或被解聚，則增多的β-catenin轉移至細胞核內，最終激活下游靶基因的表達，從而影響細胞的增殖、分化等。非經典通路由于激活信號通路的受體不同而不同，種類繁多、復雜，常見有Wnt/Ca通路、Wnt/JNK通路等。Nakatsu等[6]研究發現不同的Wnt信號相關基因優先在人角膜緣或角膜中表達，并且在調節LSCs增殖中起重要作用。實驗中發現Wnt2，Wnt6，Wnt11和Wnt16b在角膜緣處優先表達。Wnt通路中的傳導介質也已開始作為LSCs的標志物使用。

3干細胞來源

雙眼LSCD患者，無足夠的自體LSCs取材，供體細胞缺乏，這迫使研究者們尋找新的細胞來源。目前的研究，已提供了不少新的細胞來源，如胚胎干細胞、骨髓間充質干細胞、誘導多能干細胞、口腔黏膜上皮細胞等。這些細胞為雙眼LSCD的眼表重建，提供了新的細胞來源。而研究還遠遠不夠，還有更多、更好的選擇，等待學者們發現。

(1)皮下脂肪組織：由于骨髓間充質干細胞[7](bone mesenchymal stem cells, BMSCs)可考慮成為新來源，而皮下脂肪組織(subcutaneous adipose tissue, AT)更容易獲得。所以Nieto-Miguel等[8]由此研究了人類皮下脂肪組織體外衍生的MSCs(human AT-derived MSCs, hAT-MSCs)。他們從人體抽脂后分離出hAT-MSCs，擴展3～4代后，分別于塑料及膠原蛋白Ⅳ基質上培養。培養15d后通過檢測發現轉錄生長因子β受體CD105、角膜上皮標志物細胞角蛋白K12的表達增加。并認為hAT-MSCs可以成為一種新的、較BMSCs更易獲得的干細胞來源。(2)牙髓干細胞：牙髓干細胞是來源于牙髓腔的干細胞，有自我更新能力和具有多分化的潛能。其與骨髓間充質干細胞有很相似的免疫表型，在一定條件下可分化為骨、軟骨、肌細胞等。牙髓干細胞易獲得、來源廣，目前組織工程學等，已將牙髓干細胞運用于骨組織修復、神經組織修復、循環系統功能的改善等方面。Gomes等[9]將牙髓干細胞片，移植入兔眼角膜燒傷模型角膜床中，3mo后觀察，發現兔眼角膜的透明度有所好轉。Kushnerev等[10]則將用綠色熒光Qtracker525標記的牙髓干細胞接種到已預處理的角膜接觸鏡上，并以角膜接觸鏡為載體，將牙髓干細胞移植到已清創的患者角膜上。之后觀察發現牙髓干細胞在植床上分化出角膜上皮祖細胞。這一研究說明，牙髓干細胞可用于人角膜上皮的修復和再生，可能替代角膜緣干細胞成為新的干細胞移植來源。

4角膜緣干細胞培養載體

在進行LSCs體外培養時，需要有安全、可靠的載體。載體的選擇及優化是LSCs移植的一大研究熱點。

4.1目前的培養載體分類(1)生物材料：羊膜、膠原、胎鼠3T3細胞、脫細胞角膜基質、絲素蛋白等；(2)人工合成材料：纖維蛋白凝膠、聚乳酸羧基乙酸、改良的聚二甲基硅氧烷等；(3)復合材料：膠原硫酸軟骨素共混膜、聚乙烯醇-膠原、膠原結合羊膜等。

4.2新培養載體(1)新生物材料：1)人臍帶襯里細胞：胎鼠3T3細胞為一常用生物載體，但鼠緣性飼養細胞，可產生乙醇甘露糖胺丙酮酸(Neu5Gc)，這些細胞用于人體后，會激發人的免疫排斥反應，殺死外源性細胞[11]。Leonard等[12]在PTTe-1培養基中培養人臍帶襯里細胞(human umbilical cord lining cells, CLEC-muc)，并用絲裂霉素C處理后，作為新的角膜緣干細胞培養載體。同一培養系統中,發現CLEC-muc作為載體所培養的角膜緣干細胞，同胎鼠3T3細胞作為載體培養的干細胞比較，同樣表達了ABCG2等LSC相關標志物。他們認為人類的CLEC-muc可能成為胎鼠3T3細胞的合適替代品。2)非桑蠶絲：非桑蠶絲具有可控降解性和生物相容性。其轉變為生物材料的研究時間雖短，但其承載能力和拉伸強度，已可用于骨、軟骨、脂肪和其他組織的再生[13]。考慮到非桑蠶絲的這些優點，Hazra等[14]進行了對非桑蠶絲膜作為角膜緣干細胞體外培養載體的研究，發現這一支架不僅易于處理，且大鼠角膜上皮細胞等能在這一載體上發芽、遷移、附著、生長成片，并表達了細胞角蛋白K3、波形蛋白等LSCs相關標志物。這表示非桑蠶絲能支持LSCs的增長，成為新的LSCs培養載體。3)魚鱗膠原：Krishnan等[15]對魚鱗膠原進行了研究，以其為載體培養角膜緣干細胞，與羊膜載體進行比較。觀察后發現，魚鱗膠原透明度好，作為支架較羊膜物理強度更佳、上皮細胞增長率更高。同時，魚鱗膠原作為支架所培養的干細胞P63、ABCG2陽性。該研究認為魚鱗膠原有望成為新的干細胞培養支架。(2)新人工合成材料：納米纖維：Biazar等[16]將LSCs分別種植并培養于羊膜及納米纖維墊上，在培養第1、3、15d進行觀察、比較。發現納米纖維的生物相容性良好，所培養出的干細胞ABCG2、P63、細胞角蛋白K2、細胞角蛋白K13陽性，與羊膜上培養的LSCs相比，細胞表達譜無變化。所以他們認為，納米纖維可以成為羊膜的良好替代品。(3)新復合材料：絲素蛋白/殼聚糖支架：絲素蛋白由蠶所吐絲獲得，具有良好的韌性。殼聚糖則與人體內的黏多糖生物性質相似，具有良好的生物相容性。兩者在既往研究中可分別作為LSCs的培養支架。由于兩者各有優點，后有研究提出，將兩者以一定比列混合，構成新的復合材料，是更為理想的支架[17]。Kim等[18]的研究中，將絲素蛋白/殼聚糖支架中殼聚糖的質量調整為5%，認為在此比例時，支架具有良好的透明度。Fedotov等[19]則能將絲素蛋白及殼聚糖通過3D打印技術以任意的比例進行制備。由此可見，絲素蛋白/殼聚糖支架的未來可期。

5展望

1997年，Pellegrini等[20]從2例單眼嚴重堿燒傷患者的健眼角膜緣取材，體外培養后，移植到這2例患者的患眼上，重建其眼表。移植物在隨后2a的隨訪中表現穩定。這是再生醫學在眼科領域應用的第一批例子之一。2004年角膜緣干細胞移植在意大利成為患者的常規治療，并由國家衛生系統報銷。2008年在印度被接受。而在美國，由于監管要求停止此項治療[21]。2015年，Holocar藥物成為歐盟批準的首個干細胞高級療法[22]。由此可見，通過體外培養角膜緣干細胞進行移植，從而重建眼表，是很有實現商品化發展前景的，這將造福于更多的患者。但從各個國家對這一技術的態度中我們也能看出，在初次證明原理之后，我們還需要很長的時間來研究，如何控制穩定再生的機制、是否有充足的細胞來源、完善培養的流程等，并在制造過程中實現高重復性。同時，我們也面對著如何選擇患者，如何處理復雜眼表情況，如何減少異體移植排斥等問題。隨著科技的進步，學者們研究的更為深入，角膜緣干細胞移植術的使用會越來越規范，應用越來越廣闊。