年齡相關性黃斑變性患者血清miR-23a和miR-34a的表達水平及臨床意義

李慧俐，孫雅楠，韓新剛

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是一種致盲性退行性眼底病變，可分為干性和濕性兩種病理類型[1]。目前，ARMD診斷主要依靠臨床癥狀結合眼底攝影、光學相干斷層掃描和熒光素眼底血管造影檢查結果，但干性ARMD臨床癥狀不明顯，早期很難診斷，且早期診斷后無有效的預防措施[2]。因此，識別潛在相關的生物標志物，對早期診斷、預防治療，改善ARMD預后具有重要的臨床意義。miRNA參與人體多種生理病理過程，近年來研究表明，miRNA在視網膜發育和病變中發揮重要調控作用[3]。有研究對ARMD患者進行循環miRNA檢測，結果顯示216個miRNA表達異常，多個miRNA顯示出潛在的診斷價值[4]。研究表明，ARMD患者血清miR-23a和miR-34a表達異常，可能在ARMD發展中發揮調控作用[5]。因此，本研究探討miR-23a和miR-34a在ARMD患者血清中的表達水平，分析其在ARMD發病中的可能調控途徑及臨床診斷意義，以期為ARMD早期診斷和治療提供理論參考。

1對象和方法

1.1對象選取2015-05/2018-02在我院診治的ARMD患者102例為研究對象(病例組)，其中男52例，女50例；年齡53～75(平均62.58±9.32)歲；根據美國國家眼科研究所關于ARMD的分期標準[6]：早期34例，中期38例，晚期30例。另選取同期于我院體檢健康者70例作為對照組，其中男36例，女34例；年齡50～80(平均61.73±11.42)歲。納入標準：(1)ARMD患者均符合《年齡相關性黃斑變性診斷指南》中的診斷標準[7]；(2)對照組受檢者眼底檢查等各項身體指標正常，且無眼部疾病家族史。排除標準：(1)合并高血壓、糖尿病及心腦血管疾病者；(2)合并惡性腫瘤及感染性疾病者；(3)合并肝、腎功能損傷及結締組織病變者；(4)視力正常的年齡相關性玻璃膜疣、脈絡膜黑色素瘤及中心性滲出性脈絡膜炎患者；(5)合并免疫性、代謝性相關疾病及其它全身疾病者。病例組和對照組受檢者性別、年齡等一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)，病例組不同分期組患者一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準，所有受檢者均知情并自愿參與本研究。

1.2方法

1.2.1血樣采集病例組患者于確診后次日清晨采集空腹肘靜脈血5mL，對照組受檢者于體檢當日采集空腹肘靜脈血5mL，采集血樣于4℃條件下，離心10min，分離血清保存于超低溫冰箱中。

1.2.2miR-23a和miR-34a檢測采用Trizol裂解液(Invitrogen公司)提取血清總RNA，逆轉錄合成cDNA,以cDNA為模板，進行RT-PCR檢測(SuperScriptTMⅢ一步法RT-PCR系統和SYBR@Green實時PCR預混液均購于賽默飛世爾科技有限公司)。RT-PCR反應條件：93℃預變性30s；93℃變性30s，58℃/60℃退火30s，72℃延長30s，共40個循環；72℃延長10min。引物序列：miR-23a正向5’-CAGGCGGGTAGTAGATG-3’，反向5’-AGGGACGGGCATGGAAAGG-3’；miR-34a正向5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3’，反向5’-GCCATTCAGGCTAGCAGC-3’；U6內參正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。 引物均合成于上海生工生物工程有限公司。采用2-△△Ct法計算miR-23a和miR-34a相對表達量。

分期例數miR-23a相對表達量miR-34a相對表達量早期341.22±0.281.83±0.37中期381.43±0.36b2.04±0.48b晚期301.81±0.51b,d2.35±0.59b,d F18.7509.278P<0.01<0.01

注：bP<0.01vs早期；dP<0.01vs中期。

1.2.3TNF-α和NF-κB檢測采用酶聯免疫吸附法(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測兩組受檢者血清TNF-α和NF-κB水平，具體操作方法嚴格參照說明書進行。本研究所使用人TNF-α ELISA檢測試劑盒(雙抗體夾心法)和NF-κB檢測試劑盒(ELISA法)均購于上海江萊生物科技有限公司。

統計學分析：本研究采用統計學軟件SPSS22.0分析數據。血清因子表達水平等計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。血清miR-23a、miR-34a與TNF-α、NF-κB的相關性分析采用Pearson相關分析法。采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic，ROC)分析血清miR-23a和miR-34a對ARMD的診斷價值。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組受檢者血清miR-23a和miR-34a表達水平病例組患者血清miR-23a和miR-34a相對表達量(1.47±0.36和2.06±0.54)均高于對照組(0.61±0.18和0.83±0.22)，差異均有統計學意義(t=18.455、18.044，均P<0.01)，見圖1。

2.2病例組不同分期患者血清miR-23a和miR-34a表達水平病例組不同分期患者血清miR-23a和miR-34a相對表達量比較差異均有統計學意義(P<0.01)，且晚期患者血清miR-23a和miR-34a相對表達量顯著高于中期和早期患者，中期患者血清miR-23a和miR-34a相對表達量顯著高于早期患者，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表1，圖2。

2.3兩組受檢者血清TNF-α和NF-κB水平病例組患者血清TNF-α和NF-κB水平(135.62±34.57pg/mL和613.91±102.33ng/L)均高于對照組(65.98±15.83pg/mL和214.35±51.86ng/L)，差異均有統計學意義(t=15.748、7.727，均P<0.01)。

圖1兩組受檢者血清miR-23a和miR-34a相對表達量比較A：兩組受檢者血清miR-23a相對表達量；B：兩組受檢者血清miR-34a相對表達量。bP<0.01vs對照組。

圖2病例組不同分期患者血清miR-23a和miR-34a相對表達量比較A：病例組不同分期患者血清miR-23a相對表達量；B：病例組不同分期患者血清miR-34a相對表達量。bP<0.01vs早期；dP<0.01vs中期。

圖3病例組患者血清miR-23a、miR-34a與TNF-α、NF-κB的相關性分析A：血清miR-23a相對表達量與TNF-α水平的相關性；B：血清miR-23a相對表達量與NF-κB水平的相關性；C：血清miR-34a相對表達量與TNF-α水平的相關性；D：血清miR-34a相對表達量與NF-κB水平的相關性。

圖4血清miR-23a和miR-34a診斷ARMD的ROC曲線分析。

2.4病例組患者血清miR-23a、miR-34a與TNF-α、NF-κB的關系病例組患者血清miR-23a相對表達水平與TNF-α、NF-κB水平均呈顯著正相關關系(r=0.798、0.720，均P<0.01)；血清miR-34a表達水平與TNF-α、NF-κB水平均呈顯著正相關關系(r=0.814、0.740，均P<0.01)，見圖3。

2.5血清miR-23a和miR-34a對ARMD的診斷價值分析血清miR-23a診斷ARMD的ROC曲線下面積(AUC)為0.831(0.767～0.884)，診斷敏感性為75.49%，特異性為77.14%；血清miR-34a診斷ARMD的ROC曲線下面積(AUC)為0.867(0.807～0.914)，診斷敏感性為79.41%，特異性為78.57%，見圖4。

3討論

ARMD主要發生于45歲以上人群，患病率隨年齡增長而增加，已成為目前老年人視力慢性不可逆性損傷及致盲的重要眼病之一[8]。流行病學研究表明，心腦血管疾病、慢性腎病、糖尿病及遺傳、衰老等是ARMD的危險因素[9]。ARMD主要臨床特點為進行性色素上皮萎縮和脈絡膜新生血管形成及其引發的一系列病理改變，其發病過程復雜，涉及多種因素，但具體發病機制尚不完全清楚，多認為與免疫炎癥、氧化損傷、遺傳及基因突變等密切相關[10]。近年多項研究表明，ARMD患者存在不同程度氧化應激和炎癥反應，與病變嚴重程度有關，但介導氧化應激和炎癥反應發生的相關因子及途徑尚不明確。ARMD病理相關研究表明，其病變組織中存在大量巨噬細胞，通過分泌炎性因子，參與脈絡膜新生血管形成及纖維血管組織增生過程[11]。

色素上皮細胞能夠消化、吞噬壞死、脫落的感光細胞，維持視網膜內環境穩定，但這個過程中會產生大量脂肪醛自由基和氧自由基，同時色素細胞受強光照射也會誘導氧自由基產生，大量氧自由基在眼底堆積可最終導致色素上皮細胞功能損傷及視網膜氧化損傷[12]。現已證實炎癥反應和氧化應激是ARMD的重要病理機制。研究表明，miRNA與色素上皮細胞氧化應激密切相關，如miR-184在維持色素上皮細胞正常吞噬功能中發揮重要調控作用[13]。此外，miRNA還與ARMD脈絡膜新生血管形成、免疫炎癥反應有關[14]。 miR-23a是miR-23亞型之一，其在細胞分化、凋亡及炎癥反應、心臟病變中扮演重要角色[15]。Li等[16]研究表明，H2O2誘導色素上皮細胞凋亡時miR-23a表達上調，并可明顯增加色素上皮細胞對H2O2的敏感性，而抑制miR-23a表達則能夠抑制H2O2誘導的色素上皮細胞死亡，提示 miR-23a能夠促進氧化應激反應，促進人視網膜色素上皮細胞凋亡。本研究結果顯示，與正常者相比，miR-23a和miR-34a在ARMD患者血清中表達明顯上調，且血清miR-23a和miR-34a相對表達量在不同分期患者中呈逐漸升高趨勢。視網膜色素上皮細胞形成血-眼屏障，而TNF-α是破壞其屏障功能和血管生成的主要炎性細胞因子，通過p38 MAPK途徑在ARMD病理過程中發揮作用[17]。為探究血清miR-23a和miR-34a表達異常與ARMD氧化應激和炎性反應水平的關系，本研究檢測ARMD患者血清TNF-α和NF-κB水平，與正常者相比，ARMD患者血清TNF-α和NF-κB水平均顯著升高，相關性分析顯示，ARMD患者血清miR-23a和miR-34a分別與TNF-α和NF-κB呈正相關關系，表明血清miR-23a和miR-34a表達上調與氧化應激和炎癥反應有關。

衰老的主要特征包括線粒體功能失調、氧化應激、慢性低度炎癥及細胞凋亡率增加等。Rippo等[18]研究表明，miR-34a、miR-146a等miRNA在ARMD患者血清中過度表達，其靶向Bcl-2基因在細胞生長、凋亡和年齡相關疾病中發揮重要作用，其調節作用可以介導衰老細胞中線粒體完整性和功能喪失，誘導或促進炎癥反應和與年齡有關的疾病。Bhattacharjee等[19]研究發現，miR-34a通過介導小膠質富集觸發受體的下調，調節吞噬反應，在ARMD氧化應激反應中發揮重要作用。本研究發現，miR-23a和miR-34a分別與TNF-α和NF-κB呈正相關關系，推測血清miR-23a和miR-34a表達升高可促進機體炎癥因子TNF-α的釋放，激活NF-κB途徑，通過介導炎癥反應和氧化應激在ARMD發病過程中發揮促進作用。光學相干斷層掃描和熒光素眼底血管造影大大提高了ARMD早期診斷效率，在ARMD診斷中各具優勢，但由于部分患者早期臨床癥狀不明顯或無癥狀，導致上述檢查存在一定的局限性。本研究采用ROC曲線分析顯示，血清miR-23a診斷ARMD的ROC曲線下面積(AUC)為0.831，診斷敏感性為75.49%，特異性為77.14%；血清miR-34a診斷ARMD的ROC曲線下面積(AUC)為0.867，診斷敏感性為79.41%，特異性為78.57%。表明血清miR-23a和miR-34a對ARMD具有一定診斷價值。

綜上所述，ARMD患者血清miR-23a和miR-34a表達上調，可能通過促進炎性因子分泌，激活氧化應激反應，促進ARMD發生、發展，推測抑制miR-23a和miR-34a表達能夠降低炎癥和氧化應激反應，緩解病情，提高治療療效，但其是否是ARMD治療新靶點及其治療效果仍有待進一步深入研究。早期診斷對ARMD預防治療和改善預后至關重要，檢測血清miR-23a和miR-34a水平有助于早期輔助診斷，對早期干預治療具有一定的臨床指導意義。