白塞氏病患者血漿中微小RNA異常表達的初步研究

苗 慧，張新橋，王 紅

0引言

葡萄膜炎是一類常見的眼病，治療棘手，易于反復發作，治療不及時或處理不當易致盲，其主要影響青壯年人群的身心健康，受到全球眼科學界的重視[1]。多數觀點認為，葡萄膜炎是由自身免疫紊亂所致，自身免疫性葡萄膜炎主要是由Th1細胞群(主要介導細胞免疫)、Th17細胞群(主要介導炎癥反應)和調節性T細胞群(regulatory cells，Tregs；主要發揮免疫調節作用)及其分泌的相關細胞因子失去平衡引起[2]。白塞氏病(BD)是我國非常常見的一種非肉芽腫性自身免疫性葡萄膜炎，主要病理改變是閉塞性血管炎，臨床上以葡萄膜炎、口腔潰瘍、皮膚損害及陰部潰瘍為特征。BD的發病與外周血CD4+淋巴細胞亞群存在明顯的關聯，研究發現BD患者外周血中Th1細胞、Th17細胞占CD4+T細胞的百分比明顯升高，Tregs細胞占CD4+T細胞的百分比明顯下降[3-4]。

近年來，隨著對微小核糖核酸(microRNA，miRNA)研究的深入，發現miRNA在與CD4+T細胞的產生與分化相關的信號通路中起著非常重要的作用。miRNA表達關鍵酶Dicer酶的缺失明顯影響T細胞的分化與功能，這可能意味著miRNA的異常表達與自身免疫性葡萄膜炎的發病有著不可忽視的關系[3-4]。miRNA可調控免疫系統的正常發育和生理功能，其結構和功能的異常影響免疫細胞的分化、發育及功能，并參與多種自身免疫性疾病的發生、發展[5-6]。隨著二者相互作用機制的闡明及miRNA檢測技術的發展，其在自身免疫性疾病中的研究已成為miRNA研究中的前沿領域之一。上述研究結果提示，異常表達的miRNA可能在BD的發病過程中發揮重要作用，但目前關于miRNA在BD中的研究較少，很多機制尚未明確。本研究以miRNA在BD中的異常表達及探索其可能的調控路徑作為切入點，研究BD的發病機制，以期對其有更深入的認識，并為其防治提供新的治療靶點及策略。

表1Realtime-PCR引物序列

基因名稱雙向引物序列退火溫度(℃)產物長度(bp)hsa-miR-425-5pGSP:5GGGGAATGACACGATCACTC3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36065hsa-miR-34a-5pGSP:5GGGGTGGCAGTGTCTTAGC3R:5CAGTGCGTGTCGTGGAGT36064hsa-miR-34c-5pGSP:5GGGAGGCAGTGTAGTTAGC3R:5CAGTGCGTGTCGTGGAGT36066hsa-miR-129-5pGSP:5GCTTTTTGCGGTCTGG3R:5TGCGTGTCGTGGAGTC36059hsa-miR-144-3pGSP:5GGGGGGTACAGTATAGATGA3R:5CAGTGCGTGTCGTGGA36066hsa-miR-483-3pGSP:5GGGGTCACTCCTCTCCTCC3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36063hsa-miR-301a-3pGSP:5GGCGGTGCAATAGTATTGT3R:5CAGTGCGTGTCGTGGAG36065hsa-miR-454-3pGSP:5GGGGGTAGTGCAATATTGCTTA3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36066hsa-miR-224-5pGSP:5GGGGGCAAGTCACTAGTGGT3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36064hsa-miR-17-5pGSP:5GGGGCAAAGTGCTTACAGTG3R:5GTGCGTGTCGTGGAGTCG36065hsa-miR-199a-5pGSP:5GGTGCCCAGTGTTCAGAC3R:5CAGTGCGTGTCGTGGAGT36067

注：GSP表示miRNA的特異引物，R表示與GSP相匹配的引物。

1對象和方法

1.1對象選取2016-03/2017-11于我院就診的發病期BD患者15例作為BD組，均為男性，年齡23～45歲，均符合國際公認的BD診斷標準[7]，排除其它免疫性疾病及全身其他系統疾病。選取同期于我院體檢中心體檢的健康人15例作為對照組，均為男性，年齡25～41歲，排除免疫性疾病及眼部疾病。本研究經本院倫理委員會審批通過，所有受檢者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1主要試劑與設備主要試劑：Trizol LS Reagent、無RNA酶糖原(Invitrogen Life Technologies)，氯仿、異丙醇、100% 乙醇(上海化學試劑有限公司)、75%乙醇(DEPC水配制)。主要設備：Axon GenePix 4000B微陣列掃描儀(Axon Instruments，USA)、GenePix Pro 6.0軟件(Axon)、潔凈工作臺(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems)。

1.2.2提取血漿清晨采取空腹肘靜脈血4mL置于含有EDTA的紫色抗凝真空管，震蕩混勻，室溫靜置1h。將血液分裝至1.5mL無RNA酶EP管中，每管1000μL。3000r/min、20℃離心5min后觀察無溶血，提取上清液至1.5mL無RNA酶EP管中。移液過程中注意不能吸取細胞層，保持血漿不被污染，將血漿分裝后于-80℃保存。

1.2.3提取RNA分別取BD組和對照組各10例受檢者的抗凝靜脈血血漿樣品解凍后4℃ 12000r/min離心10min，取250μL血漿轉至1.5mL的離心管中，加入750μL的Trizol LS Reagent試劑混勻。勻漿后于15℃～30℃孵育5min。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，5℃～30℃孵育3min。4℃ 12000r/min離心15min，可見混合液體分為下層的紅色酚氯仿相，中間層和上層的無色水相，RNA全部于水相中。將水相轉移至新離心管，并加入500μL異丙醇，混勻后15℃～30℃孵育10min，4℃ 12000r/min離心10min，可見管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊即RNA沉淀。移去上清液，加入1mL 75%乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4℃ 7500r/min離心5min。去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5～10min，保存于-70℃備用。

1.2.4miRNA標記和miRNA陣列雜交將提取的血漿RNA樣本交由Kang Chen-Biotech(中國上海)進行miRNA標記和miRNA陣列雜交。通過Axon GenePix 4000B微陣列掃描儀掃描，GenePix Pro 6.0軟件讀取圖像的原始強度。歸一化后，將每個miRNA點獲得的平均值用于統計分析，計算綠色信號與紅色信號的比率。本研究篩選上調和下調的miRNA的閾值分別是倍數變化>2.00和倍數變化<0.50。通過miRTarBase數據庫檢索顯著差異性表達的miRNA已經過驗證的靶基因，并選取與免疫學相關的差異性表達的miRNA進行Real time-PCR驗證。

表2miRTarBase數據庫篩選出的與免疫學相關的差異性表達miRNA及其靶基因

靶基因miRNACDKN1Ahsa-miR-520b、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-654-3p、hsa-miR-17-5pMCL1hsa-miR-193-3pNotch1hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-144-3pMAP4K4hsa-miR-520eBMI1hsa-miR-300、hsa-miR-487b-3pDR1hsa-miR-513b-5pSMAD4hsa-miR-483-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-199a-5pRUNX3hsa-miR-301a-3pHLA-Ghsa-miR-152-3pDNMT1hsa-miR-152-3pJAK1hsa-miR-17-5pPTENhsa-miR-17-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-141-3pATMhsa-miR-374a-5p

表3差異性表達的miRNA的Realtime-PCR檢測結果

miRNABD組(n=5)對照組(n=5)tPhsa-miR-34c-5p1.47±0.310.78±0.243.510.0079hsa-miR-129-5p0.78±0.240.92±0.28-0.770.4654hsa-miR-34a-5p1.09±0.310.83±0.251.320.2243hsa-miR-144-3p1.09±0.170.76±0.222.400.0429hsa-miR-483-3p1.62±0.280.98±0.223.580.0072hsa-miR-301a-3p0.57±0.141.03±0.19-3.930.0044hsa-miR-224-5p0.40±0.060.73±0.18-3.580.0071hsa-miR-454-3p0.58±0.111.01±0.20-3.770.0055hsa-miR-17-5p0.63±0.121.20±0.37-6.900.0203hsa-miR-199a-5p0.34±0.110.87±0.10-5.110.0001

2結果

2.1差異性表達的miRNA本研究發現，與正常對照組相比，BD組共檢出具有差異性表達的miRNA 358個，其中上調miRNA 223個，下調miRNA 135個，見圖1。

2.2差異性表達的miRNA靶基因生物信息學分析通過miRTarBase數據庫可檢索到的本研究發現的與免疫學相關的差異性表達的miRNA靶基因見表2。本研究發現的顯著異常表達的miRNA靶基因主要集中在CDKN1A、Notch1、SMAD4，其中Notch1和SMAD4信號通路與免疫系統疾病的相關性較高，故選擇相應的miRNA進行Real time-PCR驗證。

圖1差異性表達的miRNA火山圖紅色表示符合篩選要求的miRNA。

3討論

BD是我國常見的致盲率較高的葡萄膜炎類型之一，患病人數約占全國葡萄膜炎患者總數的16.5%[8]，具有較高的代表性。BD的發病與外周血CD4+淋巴細胞亞群具有不可忽視的關系，BD患者外周血中Th1細胞、Th17細胞占CD4+T細胞的百分比明顯升高，Tregs細胞占CD4+T細胞的百分比明顯下降。隨著對miRNA的深入研究，發現當miRNA表達關鍵酶Dicer酶缺失時，Th細胞的分化與功能會受到明顯的影響，提示自身免疫性葡萄膜炎的發生可能與miRNA的異常表達有著密不可分的關系[3-4]。

miRNA是一類由基因組脫氧核糖核酸(DNA)編碼的由21～25個核苷酸序列組成的單股非編碼核糖核 酸(RNA)。miRNA雖小，但其可以直接作用于活細胞內的特異性目的基因信使核糖核酸(mRNA)的3’端非編碼區，抑制目的基因mRNA的表達，從而抑制相應蛋白質的合成，參與調節多個生理過程。miRNA的產生主要經過原始miRNA(primary microRNA，pri-miRNA)、前體miRNA(precursor microRNA，pre-miRNA)、雙體miRNA后成為成熟miRNA[5]。miRNA在動植物轉錄后水平參與基因表達調控，通過與靶分子mRNA堿基配對降解mRNA或阻礙其翻譯發揮生物學效應[9]。miRNA在免疫細胞中廣泛表達，并影響免疫反應的各個階段[5]。多種免疫過程都受到miRNA的調控，包括粒細胞發育、T細胞和B細胞的成熟與分化、抗原遞呈過程、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)的信號級聯、細胞因子的產生等[10]。循環miRNA可豐富而穩定地存在于體液中。在疾病狀態下，循環miRNA的表達譜有特征性的改變，循環miRNA可作為一種無創傷性生物標志物參與疾病的診療過程。

圖2hsa-miR-17-5p溶解曲線。

圖3hsa-miR-34a-5p溶解曲線。

圖4hsa-miR-34c-5p溶解曲線。

圖5hsa-miR-129-5p溶解曲線。

圖6hsa-miR-144-3p溶解曲線。

圖7hsa-miR-199a-5p溶解曲線。

圖8hsa-miR-224-5p溶解曲線。

圖9hsa-miR-301a-3p溶解曲線。

圖10hsa-miR-454-3p溶解曲線。

圖11hsa-miR-483-3p溶解曲線。

據推測，人類基因組中約1/3以上的基因可能是miRNA的靶基因。由于信號通路的顯著劑量敏感效應，其相關基因被認為是miRNA轉錄調控中極為理想的候選靶基因。Notch基因于1917年在果蠅中發現，因部分基因缺失可導致果蠅翅膀出現缺口(notch)而得名。哺乳動物的Notch家族包括4種受體(Notch1～4)和5種配體(DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2)，通過這些受體和配體之間的相互作用，可以將某些特定信息在相鄰細胞之間進行傳遞[11]。Notch信號通路在免疫調控中的重要性隨著研究的深入不斷彰顯出來，已有研究表明Notch信號通路在Th1和Th17細胞的分化中發揮著關鍵作用[7，12-13]。Jiao等[14]研究發現，在膠原誘導的類風濕關節炎小鼠模型中，給予γ分泌酶抑制劑(可以抑制γ分泌酶底物Notch的活性，進而影響細胞信號傳導和細胞分化)的小鼠的脾和外周淋巴結Th17細胞及白細胞介素17(interleukin 17，IL-17)的數量較對照組明顯減少，表明Notch信號通路對Th17細胞的發育、分化均發揮重要的調節作用。Zheng等[15]研究發現，腎移植術后不同恢復程度的患者中Notch1和DLL-4的表達量與Th17細胞水平的變化均呈明顯正相關，提示在腎移植急性排斥反應中Th17細胞的增殖和分化與Notch1和DLL-4密切相關。Keerthivasan等[8]應用Notch1 siRNA阻滯劑特異性阻斷Notch1信號通路，不但可以降低Th17細胞的轉錄因子視黃酸相關孤兒核受體γt(retinoid-related orphan receptor subfamily γt，RORγt)的 mRNA的表達，亦能顯著減少極化狀態下Th17細胞分泌IL-17A、IL-17F等細胞因子，提示Notch1至少可通過RORγt和IL-17基因啟動子這兩個位點調控Th17細胞分化和功能。Qi等[16]研究表明，活動期BD患者存在Notch1通道的異常激活，阻斷Notch1信號通路能傾向性抑制Th17細胞免疫反應，而這種傾向性的抑制作用可能是通過信號傳導及轉錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)的磷酸化水平來實現的。本研究結果表明，活動期BD患者血漿中hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-144-3p上調，這些miRNA的靶基因為Notch1，提示hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-144-3p的異常上調很可能參與了Notch1信號通路的異常激活。異常激活的Notch 1信號途徑通過調節STAT3磷酸化或/和通過RORγt和IL-17基因啟動子引起Th17細胞的增殖，促進BD的發病。

SMAD4蛋白作為序列保守的SMAD蛋白家族的一員，其主要功能是參與轉化生長因子β(TGF-β)超家族細胞內信號轉導。SMAD4在TGF-β超家族的信號轉導途徑中處于中樞地位，對惡性腫瘤的發生、發展及轉移有重要影響。近年有研究表明，SMAD4通過誘導致病性Th17細胞的分化參與多發性硬化的發病過程[17]。機體發生感染時，大量產生的IL-6和TGF-β通過誘導特定基因的表達影響Th17細胞的分化過程[18]。有研究進一步表明，需要在TGF-β和IL-6這兩個在宏觀上有著相反功能的細胞因子的共同作用下起始Th17細胞的分化[19]。Th17細胞的分化受RORγt和RORα共同誘導。TGF-β既能夠誘導RORγt表達又能夠誘導Foxp3的表達，在IL-6缺乏的情況下，TGF-β誘導產生的Foxp3能夠抑制細胞的進一步分化；在IL-6和TGF-β共同存在的情況下，IL-6可以通過活化Th17細胞分化中的重要調控點—STAT3，抑制Foxp3的表達并阻止其與RORγt的相互作用，使RORγt表達大幅度增加，促進Th17細胞的分化[20]。本研究結果表明，活動期BD患者血漿中hsa-miR-483-3p異常上調，hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-199a-5p異常下調，鑒于SMAD4對致病性Th17細胞的分化誘導作用，我們可以認為這些異常表達的miRNA很可能通過SMAD4參與TGF-β超家族細胞內信號轉導，在IL-6 和 TGF-β共同存在的情況下，IL-6 活化STAT3，抑制Foxp3的表達并阻止其與 RORγt 的相互作用，使 RORγt表達大幅度增加，促進Th17細胞的分化，參與BD的發病。

綜上所述，miRNA的異常表達可通過靶基因影響機體的免疫反應，促使疾病發生。本研究結果表明，miRNA的異常表達可能促進BD的發生及發展，免疫微環境中異常表達的miRNA所導致的BD患者免疫功能的異常可能是通過靶向Notch1和SMAD4來實現的，這兩條作用通路都與STAT3和RORγt相關，提示Notch1和SMAD4信號通路可能具有很強的相關性，二者在BD的發病過程中起到協同作用。但由于本研究樣本數量偏少，還需要進一步擴大樣本量以驗證上述結論，并進一步探討異常表達的miRNA與Notch1和SMAD4信號通路在BD發病機制中扮演的具體角色，這也是我們未來實驗研究的方向。