氣相色譜-負化學源-質譜法檢測水中10種全氟羧酸化合物

王曉研, 沈偉健, 王 紅, 余可垚, 吳 斌, 胡國紳, 楊功俊*

(1. 中國藥科大學藥學院, 江蘇 南京 210009; 2. 南京海關動植物與食品檢測中心, 江蘇 南京 210009)

全氟化合物(PFCs)是一系列人工合成的,碳鏈上的氫原子全部被氟原子取代的有機化合物,因其獨特的疏水疏油性被廣泛用于紡織、造紙、包裝等領域[1,2]。毒理學研究表明,PFCs可影響新陳代謝和生殖系統,并造成肝臟毒性[2]。目前,環境中存在的全氟化合物主要有全氟烷基羧酸類(PFCAs)、全氟烷基磺酸類(PFSAs)、全氟烷基磺酰胺類(PFOSAs)、全氟調聚醇(FTOHs)、全氟磷酸及其酯等。其中,全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)是環境中存在的最典型的兩種全氟化合物,也是其他PFCs在環境中轉化的最終產物。全氟化合物普遍具有難光解、水解和生物降解的特點,因此許多全氟化合物具有環境持久性,并可沿生物鏈積累放大[3]。聯合國經濟合作發展組織(OECD)及歐盟(EU)分別于2002年和2006年,將PFOS及其鹽和全氟辛烷磺酰氟認定為持久性有機污染物。2009年,聯合國斯德哥爾摩公約(Stockholm Convention)會議,正式將PFOS及其鹽和全氟辛烷磺酰氟正式列入有機污染物名單[3]。我國也在最新的食品安全國家標準[4]中對食品接觸材料及制品中PFOS和PFOA的測定做出具體規定(檢出限為1.0 ng/g,定量限為2.0 ng/g)。2018年6月,美國衛生和公共服務部曁有毒物質與疾病登記處(ASTDR)公布了有關全氟烷基化合物毒性概況的草案。

目前,全氟化合物的檢測方法主要包括氣相色譜-電子捕獲法(GC-ECD)[5]、氣相色譜-質譜法(GC-MS[6-8])、氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS[9])和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[10-17]。液相色譜法具有靈敏度高、檢出限低、對前處理要求不高等優點,已廣泛用于全氟羧酸化合物的檢測。但LC系統中存在潛在的污染問題,比如PFOA是聚四氟乙烯(PTFE)合成的助劑,而在LC系統中很多管線都是PTFE材質,因此在儀器分析時容易引起本底背景值的升高,加之密封墊上含有氟聚合物涂層等,使液相色譜法難以獲得理想的空白分析結果,且液相色譜的檢測費用較高。氣相色譜法具有檢測成本低、更為普及的優勢。使用氣相色譜法檢測全氟羧酸時[5-9],通常采用電子捕獲檢測器[5]和質譜檢測器[6-9],兩種均可達到μg/L的靈敏度。但在實際樣品的檢測過程中,GC-ECD檢測往往只作為樣品初篩的工具,陽性樣品還需要質譜法進行進一步確證。相比于液相色譜法和氣相色譜-電子捕獲法,氣相色譜-質譜法具有檢測成本低,靈敏度高以及準確度高的優勢。

由于全氟化合物極性大,沸點高,難揮發,因此不可直接進樣,要經過衍生化的過程[18]。目前,用于全氟化合物的衍生化方法主要包括硅烷化[7]、酯化[8]、柱前衍生[5]等。如Lv等[7]利用N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生PFOA和PFOS,衍生化反應在40 ℃條件下反應1 h即可完成。Ingrid等[8]通過異丙醇-硫酸與PFOS發生酯化反應,從而對PFOS進行衍生,并優化了反應中硫酸的體積分數、反應時間、提取溶劑等條件。上述衍生化反應多針對單一全氟羧酸化合物,使用同一種衍生化試劑同時衍生多種全氟羧酸化合物的報道則較少。因此選擇合適的衍生化試劑同時在合適的反應條件下對多種全氟羧酸化合物進行衍生,使所有化合物均達到最佳反應條件是氣相色譜法用于檢測全氟羧酸化合物的難點之一。

水樣中含有較多雜質,需要對其進行凈化以除去雜質干擾,同時對全氟羧酸化合物進行富集。本文采用弱陰離子固相萃取柱對水樣進行凈化富集，然后用N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)對10種全氟羧酸化合物進行衍生化,通過硅烷化降低全氟羧酸化合物的極性,并優化了反應溫度、反應時間等條件,使10種全氟羧酸化合物全部出峰且峰形良好。目前,在使用氣相色譜-質譜法檢測全氟化合物的文獻中,全部使用的是電子轟擊(EI)源,考慮到全氟化合物分子結構上含有多個氟原子,電負性很強,因此負化學源(NCI)是很好的選擇。本文對比了EI源和NCI源在檢測全氟羧酸化合物時的優劣,結果表明在使用NCI源檢測全氟化合物時,靈敏度較高且基質干擾較少。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀(配有CI源)、7890B/5977A氣相色譜-質譜聯用儀(配有EI源)(美國Agilent公司); WX-80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司); Milli-Q去離子水發生器(美國Millipore公司); NH 03079氮吹濃縮儀(美國Horizon XcelVap公司)。

標準品:全氟丁酸(PFBA)、全氟庚酸(PFHpA)、PFOA、全氟壬酸(PFNA)、全氟癸酸(PFDA)、全氟十一酸(PFUnA)、全氟十二酸(PFDoA)、全氟十三酸(PFTA)、全氟十四酸(PFTeDA)、全氟十六酸(PFHxDA)、全氟-[1,2,3,4-13C4]-辛酸,純度均大于90.0%,購自加拿大Wellington公司。正己烷、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、環己烷、二氯甲烷和甲醇均為色譜純,購自美國Burik & Jackson公司;MSTFA(含有1%(v/v)三甲基氯硅烷)購自上海源葉生物有限公司;CNW poly-sery PWAX固相萃取柱(150 mg/6 mL)購自德國CNW Technologies公司。

水樣來源:南京市內河水、自來水和飲用水。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取10 mg(精確至0.1 mg)10種標準品,分別用丙酮定容至10 mL,配制成質量濃度均為1.0 g/L的標準儲備液,于4 ℃冷藏保存。分別移取100 μL上述標準儲備液,置于10 mL容量瓶中,用丙酮稀釋并定容至刻度,配制成質量濃度為100 mg/L的混合標準工作液;用丙酮逐級稀釋,配制成0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/L的系列混合標準工作液。

準確稱取1.0 mg全氟-[1,2,3,4-13C4]-辛酸,用丙酮定容至10 mL,配制成質量濃度為0.1 g/L的內標儲備液。移取100 μL內標儲備液,置于10 mL容量瓶中,用丙酮稀釋并定容至刻度,配制成10 mg/L的內標使用液。

1.3 樣品前處理

取20 mL待測水樣,加入100 μL 10 mg/L內標使用液,過0.45 μm聚四氟乙烯濾膜,依次用0.5%(v/v)氨水甲醇溶液、甲醇和去離子水各4 mL活化CNW poly-sery PWAX固相萃取柱(2滴/s),用稀鹽酸和氫氧化鈉溶液調整水樣的pH值至8.0,然后用4 mL 40%(v/v)甲醇水溶液(pH 5)淋洗,抽干,最后用4 mL 0.5%(v/v)氨水甲醇溶液洗脫。

衍生:將上述4 mL洗脫液吹干,加入100 μL MSTFA(含有1%(v/v)三甲基氯硅烷),渦旋,于60 ℃水浴中超聲30 min,冷卻,加入900 μL乙酸乙酯,混合均勻后,供GC-NCI-MS測定。

1.4 分析條件

1.4.1GC-NCI-MS條件

色譜柱:J&W HP-5ms柱(30 m×250 μm×0.25 μm);進樣口溫度:280 ℃;程序升溫:起始溫度40 ℃,以10 ℃/min的升溫速率升至115 ℃,再以2 ℃/min的升溫速率升至125 ℃,最后以25 ℃/min的升溫速率升至250 ℃;載氣:高純氦氣(純度≥99.999%);載氣流速:0.8 mL/min;進樣量:1 μL;進樣方式:不分流進樣。

離子源:NCI源;離子源溫度:250 ℃;反應氣:甲烷(純度≥99.999%);電離能量:235 eV;輔助加熱區溫度:280 ℃;四極桿溫度:150 ℃;溶劑延遲:3 min;掃描方式:選擇離子監測模式。10種全氟羧酸化合物衍生化產物的質譜掃描參數見表1。

1.4.2GC-EI-MS條件

色譜柱:J&W HP-5ms柱(30 m×250 μm×0.25 μm);進樣口溫度:280 ℃;程序升溫:起始溫度30 ℃,保持2 min,以10 ℃/min的升溫速率升至70 ℃,保持1 min,最后以15 ℃/min的升溫速率升至250 ℃,保持2 min;載氣:高純氦氣(純度≥99.999%);載氣流速:0.8 mL/min;進樣量:1 μL;進樣方式:不分流進樣。

離子源:EI源;離子源溫度:250 ℃;反應氣:甲烷(純度≥99.999%);電離能量:70 eV;輔助加熱區溫度:280 ℃;四極桿溫度:150 ℃;溶劑延遲:4.3 min;掃描方式:選擇離子監測模式。

表 1 10種全氟羧酸化合物和內標的保留時間和監測離子Table 1 Retention times and monitored ions of the 10 perfluorinated carboxylic acid compounds and IS

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 質譜條件的建立

以MSTFA為衍生化試劑進行的硅烷化反應是一種重要的衍生方式,其衍生產物在EI源下的質譜碎片解析已有相關報道[19]。以全氟辛烷羧酸為例,推測其在NCI源下的質譜裂解規律見圖1。在GC-NCI-MS模式下,以甲烷為反應氣,在高能電子束(>70 eV)轟擊下,Si-O鍵斷裂,形成m/z為414.0和413.0的離子,這兩個離子不穩定,繼續脫去一個氟原子形成環氧鍵(m/z=394.0)或連續脫去兩個氟原子形成雙鍵(m/z=376.0)。全氟辛烷羧酸衍生化產物的質譜圖如圖2所示,可知推測的碎片離子與實驗獲得的全氟辛烷羧酸的質譜圖碎片一致,因此實驗選擇m/z為394.0、395.0和376.0的離子作為全氟辛烷羧酸衍生化產物的質譜監測離子。其余9種全氟羧酸化合物與全氟辛烷羧酸結構相似,只是碳鏈長度不同,其質譜裂解機理相同,且與實驗獲得的質譜碎片一致。

圖 1 全氟辛烷羧酸衍生化產物的質譜裂解圖Fig. 1 MS fragmentation diagram of derivative of PFOA

圖 2 全氟辛烷羧酸衍生化產物的質譜圖Fig. 2 Mass spectrum of derivative of PFOA

2.2 衍生化反應條件的優化

2.2.1衍生化試劑的選擇

全氟化合物極性較大,沸點較高,不易氣化,需要進行衍生化反應使極性和沸點得到有效降低,從而適用于氣相色譜分析。目前文獻報道的用于全氟化合物衍生化反應的有利用異丙醇和硫酸與全氟辛烷羧酸和全氟辛烷磺酸進行酯化反應[8];利用BSTFA與全氟辛烷羧酸和全氟辛烷磺酸進行硅烷化反應[7];利用2,4-二氟苯胺為衍生化試劑以及利用N,N′-二環己基碳二亞胺為脫水劑與全氟辛烷羧酸形成酰胺化合物[20]。

硅烷化反應是一類經典的衍生化反應,利用硅烷化試劑的三甲基硅基取代目標化合物的活潑氫,從而降低目標化合物的極性,增加揮發性[20]。較為常用的硅烷化反應試劑有BSTFA、N,O-雙三甲基硅基乙酰胺(BSA)和MSTFA。硅烷化反應在檢測多種物質方面均有應用[14-18],崔慶新等[21]用三甲基氯硅烷衍生維生素C,從而實現氣相色譜-質譜聯用法測定橙汁粉中的維生素C。

本實驗考察了不同衍生化試劑的衍生化效果,包括異丙醇-硫酸、五氟芐基溴、BSA、BSTFA和MSTFA。實驗結果顯示,異丙醇-硫酸和五氟芐基溴對10種全氟羧酸化合物標準品進行衍生化后,沒有檢測到衍生化后的產物,可能是因為衍生化反應不成功或衍生化產物不穩定。采用BSA、BSTFA進行衍生化,衍生化雜質相對于采用MSTFA時多,對目標產物產生較多干擾,因此最終選擇MSTFA對10種全氟羧酸化合物進行衍生化。以全氟辛烷羧酸為例,MSTFA對全氟羧酸類衍生化的原理圖見圖3。

圖 3 全氟辛烷羧酸的衍生化原理圖Fig. 3 Derivative principle diagram of PFOAMSTFA: trifluoro-N-methyl-N-(trimethylsilyl) acetamide.

2.2.2反應時間對衍生效率的影響

取1 mL 1 mg/L的混合標準工作液,加入螺旋口玻璃小瓶中,氮氣吹干后,加入100 μL MSTFA,于60 ℃反應10、20、30、40和50 min,考察不同反應時間對10種全氟羧酸化合物衍生效果的影響。結果如圖4a所示,反應時間為30 min時,除PFUnA外,其余9種全氟羧酸化合物的峰面積均達到最大值。因此選取30 min作為衍生化反應的時間。

圖 4 (a)反應時間、(b)反應溫度、(c)超聲和(d)衍生化試劑用量對衍生化產物峰面積的影響Fig. 4 Effects of (a) reaction time, (b) reaction temperature, (c) ultrasound and (d) amount of derivation agent on the peak areas of the derivative products

2.2.3反應溫度對衍生效率的影響

取1 mL 1 mg/L的混合標準工作液,加入螺旋口玻璃小瓶中,氮氣吹干后,加入100 μL MSTFA,分別于30、40、50, 60、70和80 ℃反應30 min,考察反應溫度對衍生效果的影響。結果如圖4b所示,當反應溫度為60 ℃時,10種全氟羧酸化合物的峰面積均達到最大值;繼續升高反應溫度,峰面積反而下降。因此,60 ℃為衍生化反應的最佳溫度。

2.2.4超聲對衍生化效率的影響

樣品經1.3節所述,洗脫液吹干后加入MSTFA,再進行簡單渦旋后衍生。在此過程中,樣品吹干后的殘渣可能并沒有與衍生化試劑充分混合,且考慮到在超聲時,超聲波可加快分子運動,因此考察了超聲是否能提高衍生化效率,并在超聲過程中用溫度計監測水浴溫度,將溫度控制在(60±2) ℃之間。取1 mL 1 mg/L的混合標準工作液,加入螺旋口玻璃小瓶中,氮氣吹干后,加入100 μL MSTFA,分別于60 ℃在超聲和不超聲的條件下反應30 min。結果如圖4c所示,在反應過程中,超聲可以明顯增加衍生化反應的效率,尤其是對PFBA和PFOA而言。

2.2.5衍生化試劑用量對衍生效率的影響

取1 mL 1 mg/L的混合標準工作液,加入螺旋口玻璃小瓶中,氮氣吹干后,分別加入80、100、120和140 μL的MSTFA,于60 ℃水浴超聲反應30 min,比較衍生化試劑用量對衍生效率的影響。結果如圖4d所示,當衍生化試劑的用量達到100 μL后,再增加衍生化試劑的用量,10種全氟羧酸的峰面積沒有太大變化。因此,使用100 μL的衍生化試劑進行衍生化反應。

2.2.6溶劑對衍生化產物測定的影響

在對目標化合物進行衍生化后,衍生化產物的分子結構上增加了一個三甲基硅烷結構,有效降低了目標化合物的極性。因此,需要找到合適極性的溶劑對衍生化產物進行定容,保證10種全氟羧酸化合物的衍生化產物都可以溶解且峰形較好。實驗分別比較了丙酮、乙腈、環己烷、正己烷、乙酸乙酯、甲醇和二氯甲烷7種溶劑對衍生化產物的溶解效果。結果顯示,用乙酸乙酯和二氯甲烷溶解時,可檢測出全部10種全氟羧酸化合物,但相對于二氯甲烷,乙酸乙酯的毒性較低。因此選擇乙酸乙酯為溶劑定容衍生化產物。

2.3 前處理條件的優化

2.3.1水樣的pH值

水樣采用弱陰離子交換固相萃取柱CNW poly-sery PWAX進行樣品前處理,以1 mg/L的混合標準溶液作為測試溶液。全氟羧酸類物質在堿性條件下為陰離子,與弱陰離子固相萃取柱實現交換,因此實驗考察了水樣pH值分別為7.5、8.0、8.5、9.0和9.5時,與弱陰離子固相萃取柱達到交換的程度。結果表明,當水樣pH值為8.0時,10種全氟化合物的回收率均在70%～95%之間;其余條件下均出現一種或幾種全氟羧酸化合物的回收率小于70%的情況。因此將水樣的pH值調節至8.0。

2.3.2淋洗液甲醇的體積分數和pH值

考察了淋洗液甲醇水溶液中甲醇的體積分數及其pH值對10種全氟化合物回收率的影響。結果表明,當淋洗液pH值為5、甲醇的體積分數為40%時,10種全氟化合物的回收率均能達到70%以上,因此選擇40%(v/v)甲醇水溶液(pH 5)作為淋洗液。

2.3.3洗脫液中氨水的比例

固定淋洗液為40% (v/v)甲醇水溶液(pH 5),水樣pH值為8.0,考察洗脫液甲醇中氨水的體積分數(0.1%、0.5%、1.0%和1.5%)對10種全氟羧酸化合物回收率的影響。因PFHxDA的靈敏度較低,需優先考慮，當使用0.5%(v/v)氨水甲醇時,其回收率可以達到70%以上,其余9種全氟羧酸的回收率均能達到80%以上。因此,綜合考慮10種全氟羧酸化合物的回收率,選擇0.5%(v/v)氨水甲醇為最終的洗脫液。

圖 5 采用GC-EI-MS和GC-NCI-MS時加標河水樣品中 10種全氟羧酸化合物的選擇離子色譜圖Fig. 5 Selected ion chromatograms of the 10 perfluorinated carboxylic acid compounds in spiked river samples by GC-EI-MS and GC-NCI-MS EI: electron impact; NCI: negative chemical ionization.

2.4 離子源的選擇

按照上述建立的方法對加標(10 mg/L)河水樣品進行前處理,然后分別進行GC-EI-MS和GC-NCI-MS測定(見圖5)。結果表明,兩種方法都可以測定出10種全氟羧酸化合物,但采用GC-EI-MS時,目標峰附近出現較多雜峰,易對目標化合物的檢測產生干擾;而采用GC-NCI-MS時,目標化合物周圍幾乎沒有雜峰干擾,GC-NCI-MS的抗基質干擾能力更強。

同時比較了GC-EI-MS和GC-NCI-MS對10種全氟羧酸化合物的靈敏度。采用GC-NCI-MS時,10種全氟羧酸化合物的檢出限為0.5～1.5 μg/L;而采用GC-EI-MS時,10種全氟羧酸化合物的檢出限為7.5～10 μg/L,說明GC-NCI-MS對全氟羧酸類物質具有更高的靈敏度。

表 2 10種全氟羧酸化合物的回歸方程、相關系數(r2)、 檢出限和定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the 10 perfluorinated carboxylic acid compounds

Y: peak area ratio of the quantitative ion of the analyte to the internal standard;X: mass concentration, mg/L.

表 3 空白加標水樣中10種全氟羧酸化合物的平均 回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 10 perfluorinated carboxylic acid compounds spiked in blank water samples (n=6)

圖 6 10種全氟羧酸化合物混合標準工作液(10 mg/L) 的選擇離子色譜圖Fig. 6 SIM chromatogram of the 10 perfluorinated carboxylic acid compounds in a mixed standard solution (10 mg/L)

2.5 方法學評價

2.5.1線性范圍、檢出限和定量限

對1.2節配制的系列混合標準工作液進行分析(含內標1 mg/L), 10種全氟羧酸化合物經衍生化后的總離子流色譜圖見圖6。采用內標法進行定量,以各組分定量離子與內標定量離子峰面積的比值(Y)對其質量濃度(X, mg/L)進行線性回歸,得到10種全氟羧酸化合物的線性方程(見表2)。10種全氟羧酸化合物的線性相關系數均大于0.995,說明10種全氟羧酸化合物在0.1～10.0 mg/L范圍內線性關系良好。根據3倍和10倍信噪比分別確定10種全氟羧酸化合物的檢出限和定量限,結果見表2。

2.5.2回收率與精密度

在陰性水樣中分別添加100 μL質量濃度為1、10和100 mg/L的混合標準工作液(添加水平相當于0.005、0.05和0.5 mg/L),按1.3節描述進行前處理和衍生,然后在GC-NCI-MS實驗條件下進樣。每個添加水平平行做6個樣品,每個樣品重復測定兩次,計算10種全氟羧酸化合物的平均回收率和相對標準偏差(RSD),結果見表3。結果表明,10種全氟羧酸化合物的平均回收率為70.2%～112.6%, RSD為2.1%～14.5%(n=6),說明建立的方法準確、可靠。

2.5.3實際樣品分析

采用本文建立的方法,對南京市內河水、自來水以及飲用水樣品進行檢測,結果顯示,在河水中檢測到PFHpA、PFOA和PFDA,含量分別為2.5、4.3和6.2 ng/L;在自來水中只檢測到PFOA,含量為1.3 ng/L;在飲用水中未檢測到全氟羧酸類物質。

3 結論

本文采用NCI源建立了氣相色譜-質譜聯用測定水中10種全氟羧酸化合物的分析方法。本方法采用NCI源對全氟羧酸類化合物進行測定,結果表明,NCI源的靈敏度以及抗基質干擾能力優于EI源,線性相關性好,準確度高。為全氟羧酸化合物的檢測提供了新方法。